Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Структура и функции Na,K-ATPазы 11
1.1.1. Молекулярная организация Na,K-ATPазы 11
1.1.2. Изоформы Na,K-ATPазы 15
1.1.3. Каталитический цикл и конформации Na,K-ATPазы 19
1.1.4. Механизм работы Na,K-ATPазы 20
1.1.5. Протеолиз, как метод изучения Na,K-ATPазы 23
1.1.6. Кардиотонические стероиды 27
1.1.7. Функции Na,K-ATPазы 30
1.1.8. Na,K-ATPаза и белки-партнёры 34
1.1.8.1. Гамма-субъединица 34
1.1.8.2. Цитоскелет (анкирин, аддуцин, тубулиновый цитоскелет) 37
1.1.8.3. Src-киназа 38
1.1.8.4. Кавеолины 39
1.1.8.5. Мелиттин и мелиттин-подобные белки 40
1.1.8.6. Hsp70 41
1.2. Регуляция активности Na,K-ATPазы и роль посттрансляционных модификаций этого фермента 43
1.2.1. Регуляция работы Na,K-ATPазы путем фосфорилирования 43
1.2.2. Окислительный стресс 46
1.2.3. Глутатион 47
1.2.4. Механизмы глутатионилирования белков 49
1.2.5. Цистеиновые остатки Na,K-ATPазы и других белков 52
1.2.6. S-глутатионилирование Na,K-АТРазы 58
Глава 2. Материалы и методы 62
2.1. Получение очищенного препарата Na,K-ATPазы 62
2.2. Определение концентрации белка 63
2.3. Определение активности Na,K-ATPазы 63
2.4. Электрофорез в полиакриламидном геле 64
2.5. Иммуноблоттинг 65
2.6. Глутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы 66
2.7. Деглутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы 66
2.7.1. Получение препарата очищенной Na,K-ATPазы в присутствии восстановителей 66
2.7.2. Деглутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы c использованием ферментативной системы 66
2.7.3. Деглутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы с использованием химических восстановителей 67
2.8. Трипсинолиз Na,K-АТРазы 67
2.9. Масс-спектрометрический анализ 68
2.10. Изотермическая калориметрия титрования (ИКТ) 68
2.11. Глутатионилирование в клеточной культуре и иммунопреципитация 69
2.12. Статистические методы обработки результатов 70
2.13. Использованные реактивы 70
Глава 3. Результаты и их обсуждение 71
3.1. Характеристика препарата Na,K-ATPазы из солевых желёз утки 71
3.2. Глутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы 73
3.2.1. Глутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы in vitro 73
3.2.2. Глутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы, находящейся в различных конформациях 74
3.2.3. Глутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы in situ 76
3.3. Деглутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы 77
3.3.1. Получение препарата очищенной Na,K-ATPазы в присутствии восстановителей 77
3.3.2. Деглутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы с использованием ферментативной системы 78
3.3.3. Деглутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы с использованием химических восстановителей 80
3.3.4. Деглутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы с использованием химических восстановителей в присутствии денатурирующих агентов 82
3.3.5. Деглутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы в составе микросом с использованием химических восстановителей в присутствии денатурирующих агентов 84
3.3.6. Деглутатионилирование 1-субъединицы Na,K-ATPазы на PVDF мембране с использованием химических восстановителей 84
3.3.7. Деглутатионилирование 1-субъедницы Na,K-ATPазы с использованием химических восстановителей в присутствии денатурирующих агентов при высоких температурах 85
3.3.8. Иные модификации SH-групп 1-субединицы Na,K-ATPазы и их восстановление химическими восстановителями 87
3.3.9. Идентификация цистеиновых остатков 1-субъединицы Na,K-ATPазы, поддающихся и не поддающихся деглутатионилированию 88
3.4. Ограниченный трипсинолиз 1-субъединицы Na,K-ATPазы 90
3.4.1. Трипсинолиз 1-субъединицы Na,K-ATPазы в присутствии 150 мМ KCl 91
3.4.2. Трипсинолиз 1-субъединицы Na,K-ATPазы в присутствии 150 мМ NaCl 92
3.4.3. Трипсинолиз 1-субъединицы Na,K-ATPазы в присутствии 0,5 мМ уабаина 94
3.5. Влияние степени глутатионилирования Na,K-ATPазы на ее связывание с лигандами 96
3.5.1. Связывание Na, K-ATPазы с уабаином 96
3.5.2. Связывание Na, K-ATPазы с Hsp70 98
Заключение 100
Выводы 104
Список цитируемой литературы 106
Приложение 127
