Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 8
1.1. Перемещающиеся элементы генома 8
1.1.2. Ретроэлемепты 9
1.1.1.1. LTR-Ретротранепозоны 10
1.1.2. Ретровирусы 12
1.1.3. Эндогенные ретровирусы 12
1.1.3.1. Строение эндогенных ретровирусов человека 13
1.1.3.2. Происхождение эндогенных ретровирусов 15
1.1.3.3. Классификация эндогенных ретровирусов 17
1.1.3.4. Представленность и распределение ERV в геноме человека 19
1.1.3.5. Участие HERV в нормальных и патофизиологических процессах, протекающих в клетке 22
1.3.1.1. Участие ERV в эмбриогенезе и развитии плаценты 24
1.1.3.1. Различия в структуре LTR, влияющие на их транскрипционную активность... 26
1.1.3.2. Эндогенные и экзогенные факторы, влияющие на экспрессию HERV 30
1.1.3.3. Влияние эндогенных ретровирусов и одиночных LTR на функционирование генома человека 33
1.1.4. Ретровирусные регуляторы экспрессии генов в геноме человека, как возможные факторы его эволюции 41
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 45
2.1. Материалы 45
2.1.1. Оборудование 45
2.1.2. Расходные материалы 46
2.1.3. Реактивы и ферменты 46
2.1.4. Буферные и концентрированные растворы 47
2.1.5. Препараты геномной ДНК. 48
2.1.6. Ткани. 49
2.1.6. Штаммы, культуры, плазмиды 51
2.1.1. Праймеры, последовательность нуклеотидов 52
2.2. Методы 53
2.2.1. Выделение РІЖ. 53
2.2.1.1. Подготовка тканей 53
2.2.1.2. Подготовка клеток 53
2.2.1.3. Выделение РНК 54
2.2.1.4. Определение концентрации РНК 55
2.2.1.3.Анализ выделенной РЫК методом гель-электрофореза 55
2.2.1.6. Обработка препарата РНК ДНКазой 55
2.2.2. Синтез первых цепей кДНКна матрице суммарной РНК. 56
2.2.3. Выделение ДНК. 57
2.2.3.1. Выделение плазмидной ДНК 57
2.2.3.2. Выделение высокомолекулярной ДНК 57
2.2.4. Очистка олигонуклеотидных праймеров 58
2.2.5. Полимеразная цепная реакция (PCR) 59
2.2.5.1. Стандартная пропись PCR-амшшфикации 59
2.2.5.2. RT-PCR-амплифшеациг 60
2.2.5.3. Приготовление матрицы для PCR из суспензии клеток 60
2.2.6. Электрофорез в агарозном геле 61
2.2.7. Определение концентрации фрагментов ДНК. 61
2.2.8. Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и PCR фрагментов на автоматическом секвенаторе 61
2.2.9. Трансформация Е. coll 61
2.2.10. Рестрикция и лавирование 62
2.2.10.1. Аналитическая рестрикция выделенных плазмид 62
2.2.10.2. Препаративная рестрикция, выделение и очистка плазмид и фрагментов ДНК. 63
2.2.10.3. Лигирование 63
2.2.11. Культивирование клеток 64
2.2.12. Трансфекция клеток. 64
2.2.13. Позитивно-негативная селекция 65
2.2.14. Получение клеточного лизата. 65
2.2.15. Определение количества белка 66
2.2.16. Определение флуоресценции EGFP в клеточныхлизатах. 66
2.2.17. Определение активности люциферазы 66
2.2.18. 5 RACE (Rapid Amplification of 5 cDNA Ends) 67
2.2.19. Программное обеспечение 69
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Теоретическое обоснование работы и экспериментальные задачи 71
3.2. Анализ транскрипта, содержащего в своем составе LTR HERV-K 72
3.3. PCR-анализ локусов, различающихся по присутствию LTR HERV-K 74
3.4. Филогенетический анализ представителей подсемейства KIAA1245 генома человека 75
3.5. Определение возраста интеграции LTR в предковую последовательность LTR-содержащих генов 76
3.6. Сравнение последовательностей представителей подсемейства К1АА1245 различных приматов 78
3.7. Анализ транскрипции генов подсемейства КІАА1245 80
3.7.1. Анализ транскрипции генов подсемейства К1АА1245 в нормальных тканях человека 81
3.7.2. Анализ транскрипции генов подсемейства К1АА1245 в опухолевых тканях человека и трансформированных клеточных линиях 82
3.7.3. Анализ транскрипции генов подсемейства К1АА1245 в эмбриональных тканях человека 83
3.7.4. Анализ транскрипции LTR-содержащих генов подсемейства КІАА1245 85
3.7.5. Вклад каждого из LTR-содержаіцих генов в общую транскрипцию 90
3.8. Экспериментальное подтверждение энхансерной активности исследуемого LTR . 91
3.9. Роль LTR в транскрипции генов подсемейства КІАА1245 95
3.9.1. Расположение генов на хромосомах 95
3.9.2. Анализ регуляторних последовательностей в промоторных областях генов 96
3.9.3. Метилирование промоторных областей генов 97
3.10. Анализ промоторной активности исследуемого LTR HERV-K 99
3.11. Определение промоторной активности исследуемого LTR in vitro 104
Выводы 108
Список литературы 109
