Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Структурная организация митохондрий растений 15
1.2. Структурная организация основной цепи переноса электронов 19
1.2.1. Комплекс I (ротенон-чувствительная НАДН-дегидрогеназа) 19
1.2.2. Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа) 20
1.2.3. Комплекс III (цитохром bc1-оксидоредуктаза) 21
1.2.4. Комплекс IV (цитохромоксидаза) 22
1.3. Альтернативные пути переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий растений 22
1.3.1. Ротенон-нечувствительные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы 22
1.3.2. Альтернативная цианид-резистентная оксидаза 23
1.4. Митохондриальный АТФ-синтетазный комплекс (комплекс V) 30
1.5. Физиологический смысл сопряженного и разобщенного дыхания 31
1.6. Митохондриальная пора повышенной проницаемости у растений 35
1.7. Роль гормонов в регуляции дыхания митохондрий 42
1.7.1. Влияние салициловой кислоты на функциональную активность митохондрий растений 45
Глава II. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования 54
2.1.1. Характеристика Lupinus luteus и Lupinus angustifolius -основных объектов исследования 54
2.1.2. Характеристика Beta vulgaris, дополнительного объекта исследования 55
2.2. Получение растительного материала для лабораторного исследования 56
2.3. Постановка эксперимента по изучению влияния салициловой кислоты на функциональное состояние митохондрий растений 57
2.4. Выделение и очистка интактных митохондрий растений 58
2.5. Критерии интактности митохондрий 60
2.6. Определение целостности митохондриальных мембран 61
2.7. Изучение метаболической активности митохондрий растений 64
2.7.1. Определение скорости окисления дыхательных субстратов в митохондриях, коэффициента ДК и отношения АДФ/О 64
2.7.2. Определение скорости дыхания семядолей люпина и активности терминальных оксидаз 66
2.7.3. Измерение мембранного потенциала митохондрий 67
2.7.4. Определение образования перекиси водорода митохондриями 68
2.7.5. Изучение набухания митохондрий 69
2.8. Введение плазмидной ДНК в бактериальные клетки 69
2.8.1. Выращивание культуры бактериальных клеток 69
2.8.2. Приготовление компетентных бактериальных клеток 70
2.8.3. Лигирование фрагментов ДНК с вектором pTZ57R 71
2.8.4. Трансформация бактериальных клеток 72
2.9. Секвенирование ДНК 72
2.10. Выделение нуклеиновых кислот из растений 73
2.10.1. Выделение геномной ДНК 73
2.10.2. Выделение суммарной РНК 73
2.10.3. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток с использованием щелочного лизиса (метод Бирнбойма – Доли) 74
2.10.4. Определение количества и качества нуклеиновых кислот 75
2.10.5. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 76
2.11. Метод полимеразной цепной реакции 76
2.11.1. Подбор праймеров к целевым генам 77
2.11.2. Синтез кДНК методом обратной транскрипции 78
2.11.3. Полимеразная цепная реакция 79
2.12. Статистическая обработка данных 80
Глава III. Результаты и обсуждение
3.1. Характеристика метаболической активности митохондрий, выделенных из семядолей этиолированных проростков Lupinus luteus и корнеплодов Beta vulgaris 81
3.2. Активация альтернативного дыхания при действии салициловой кислоты на интактные семядоли Lupinus luteus 86
3.2.1. Влияние салициловой кислоты на активность различных путей митохондриального окисления в тканях семядолей 86
3.2.2. Влияние салициловой кислоты на активность альтернативного и цитохромоксидазного путей в митохондриях семядолей 88
3.3. Влияние салициловой кислоты на экспрессию генов альтернативной оксидазы Lupinus luteus 89
3.3.1. Определение нуклеотидных последовательностей генов альтернативной оксидазы Lupinus luteus 89
3.3.2. Влияние салициловой кислоты на накопление транскриптов генов альтернативной оксидазы Lupinus luteus 92
3.4. Влияние салициловой кислоты на метаболическую активность изолированных митохондрий исследуемых растений 95
3.4.1. Влияние салициловой кислоты на дыхание митохондрий Lupinus luteus и Beta vulgaris 95
3.4.2. Влияние салициловой кислоты на генерацию мембранного потенциала митохондрий Lupinus luteus и Beta vulgaris 100
3.4.3. Влияние салициловой кислоты на проницаемость митохондриальной сопрягающей мембраны Lupinus angustifolius и Beta vulgaris 102
3.4.4. Влияние салициловой кислоты на генерацию перекиси водорода в митохондриях Lupinus angustifolius 114
Заключение 117
Выводы 121
Список литературы 122
