ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................ 6
Актуальность темы исследования и степень её разработанности................................................. 6
Цели и задачи работы....................................................................................................................... 10
Основные положения, выносимые на защиту ............................................................................... 11
Научная новизна ............................................................................................................................... 11
Теоретическая и практическая значимость работы ...................................................................... 12
Личный вклад автора ....................................................................................................................... 12
Финансовая поддержка работы....................................................................................................... 13
Объём и структура диссертации ..................................................................................................... 13
Апробация работы............................................................................................................................ 13
Список работ, опубликованных по теме диссертации.................................................................. 14
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................. 17
1.1. Регуляция ответа клетки при повреждении ДНК................................................................... 17
1.1.1. Факторы приводящие к повреждению ДНК................................................................. 17
1.1.2. Ответ клетки на повреждение ДНК............................................................................... 18
1.1.3. Пути реализации ответа на повреждение ДНК в клетках млекопитающих.............. 19
1.1.4. Двухцепочечные разрывы молекулы ДНК. .................................................................. 21
1.1.4.1. Пути репарации двухцепочечных разрывов .......................................................... 22
1.1.4.2. Негомологичное соединение концов...................................................................... 23
1.1.4.3. Репарация при помощи гомологичной рекомбинации ......................................... 28
1.1.4.4. Регуляция выбора пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК.................. 31
1.2. ДНК-повреждающие агенты в терапии рака лёгкого ............................................................ 36
1.2.1 Ингибиторы топоизомеразы II........................................................................................ 38
1.2.2. Препараты платины......................................................................................................... 42
1.3. Роль NF-κB в канцерогенезе..................................................................................................... 46
1.3.1. Пути активации транскрипционного фактора NF-κB.................................................. 48
1.3.2. Участие NF-κB в реализации ответа клетки на повреждение ДНК ........................... 503
1.4. Роль ACTN4 в канцерогенезе................................................................................................... 54
1.4.1. Структура и основные функции ACTN4....................................................................... 54
1.4.2. ACTN4 как транскрипционный ко-активатор .............................................................. 57
1.4.3. ACTN4 как предиктивный маркер прогрессии туморогенеза и исхода
терапии...................................................................................................................................... 60
1.5. hnRNP в регуляции ответа клетки на повреждение ДНК...................................................... 65
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................... 69
Материалы......................................................................................................................................... 69
2.1. Клеточные линии....................................................................................................................... 69
2.2 Праймеры .................................................................................................................................... 69
Методы .............................................................................................................................................. 70
2.2. Культивирование клеток и манипуляции с плазмидами ....................................................... 70
2.3. Анализ клеточного цикла и апоптоза ...................................................................................... 71
2.4. Анализ цитотоксичности .......................................................................................................... 72
2.5 Оценка эффективности репарации разрывов ДНК при помощи метода ДНК-комет в
щелочных условиях.......................................................................................................................... 72
2.6. Иммуноокрашивание клеток .................................................................................................... 74
2.7. Получение белковых проб. Внутриклеточное фракционирование и иммуногибридизация
............................................................................................................................................................ 75
2.8. Иммунопреципитация............................................................................................................... 79
2.9. Двумерный электрофорез......................................................................................................... 80
2.10. Масс-спектрометрия................................................................................................................ 80
2.11. Анализ экспрессии генов методом ОТ-ПЦР в реальном времени...................................... 81
2.12. Анализ основных путей репарации двухцепочечных разрывов ДНК при помощи
репортерных плазмид....................................................................................................................... 83
2.13. Статистическая обработка результатов................................................................................. 84
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ................................................................................................................ 85
3.1. Нокаут ACTN4 повышает устойчивость клеток H1299 к генотоксическому стрессу ....... 85
3.2. Нокаут ACTN4 в клетках Н1299 усиливает эффективность репарации разрывов ДНК,
вызванных ингибиторами топоизомеразы II ................................................................................. 944
3.3. ACTN4-зависимая регуляция репарации двухцепочечных разрывов ДНК не зависит от
активности транскрипционного фактора NF-κB........................................................................... 98
3.3.1. Анализ NF-κB зависимых генов .................................................................................... 98
3.3.2. Конститутивная активация RelA/p65 субъединицы NF-κB не оказывает влияния на
устойчивость клеток НМКРЛ к ДНК-повреждающим препаратам и эффективность
репарации ДНК в клетках линии H1299 ............................................................................... 102
3.4. ACTN4 вовлечён в регуляцию выбора пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК в
клетках H1299 ................................................................................................................................. 104
3.4.1. ACTN4 присутствует в ядерной фракции белков, тесно связанных с хроматином104
3.4.2. Низкая экспрессия ACTN4 сдвигает соотношение между NHEJ и HRR в пользу
первого пути............................................................................................................................. 107
3.4.3. ACTN4 вовлечён в регуляцию сборки комплексов репарации ДНК ....................... 110
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................................................ 123
4.1. ACTN4-зависимая резистентность клеток линий НМКРЛ к действию этопозида
обусловлена регуляцией ответа клетки на повреждение ДНК .................................................. 125
4.2. ACTN4-зависимая регуляция репарации двухцепочечных разрывов ДНК не зависит от
активности транскрипционного фактора NF-κB......................................................................... 130
4.3. ACTN4 вовлечён в регуляцию выбора пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК в
клетках H1299 ................................................................................................................................. 134
ВЫВОДЫ....................................................................................................................................... 145
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................... 146
ПРИЛОЖЕНИЕ............................................................................................................................ 170
БЛАГОДАРНОСТИ..................................................................................................................... 172
