Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1 Лигнинолитическая система базидиальных грибов 9
1.1.1 Лигнинолитический комплекс грибов 9
1.1.2 Множественные формы лигиинолитических ферментов 10
1.1.3 Синергизм действия лигиинолитических ферментов, роль марганца в процессе деградации лигнина 13
1.2 Основные ферменты лигнинолитического комплекса базидиомицетов 18
1.2.1 Лакказа 18
1.2.2 Лигнинпероксидаза 34
1.2.3 Марганецпероксидаза 37
1.3 Базидиальные грибы рода trametes 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 45
2.1 Материалы и объекты исследования 45
2.1.1 Штаммы микроорганизмов и ферменты 45
2.1.2 Носители для хроматографии 45
2.1.3 Реагенты 45
2.2 Культивирование базидиомицета trametes pubescens 46
2.2.1 Культивирование на глюкозо-аммонийной среде 46
2.2.2 Культивирование на мелассе 47
2.3 Выделение и очистка ферментов 47
2.4 Определение молекулярной массы и изоэлектрофокусирование 48
2.5 Контроль активности ферментов 48
2.5.1 Контроль активности лакказы 49
2.5.2 Контроль активности лигнинпероксидазы 49
2.5.3 Контроль активности марганецпероксидазы 49
2.5.4 Определение активности целлобиозодегидрогеназы 49
2.6 Кинетические измерения и рн-зависимость 50
2.6.1 Регистрация окисления ионов Мп + до Мп +, катализируемого лакказой 50
2.6.2 Исследование продуктов реакции окисления ионов Мп +, катализируемой лакказой 51
2.7 Аналитические методы 51
2.7.1 Определение концентрации белка 51
2.7.2 Определение металлов 51
2.7.3 Определение углеводной части лакказ 52
2.8 Спектральные исследования 52
2.9 Масс-спектроскопические исследования 52
2.9.1 Расщепление белков 52
2.9.2 MALDI-массспектроскопия 53
2.9.3 Расчет данных 53
2.10 Электрохимические исследования 54
2.10.1 Приготовление электродов 54
2.10.2 Циклические вольтамперометрические измерения 54
2.10.3. Амперометрические исследования биосенсоров 55
2.10.4 Определение окислитиельно-восстановителъного потенциала ТІ центра лакказы 55
ГЛАВА 3. Результаты исследования 57
3.1 Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета trametes pubescens 57
3.2. Физико-химические свойства ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета trametes pubescens 61
3.2.1 Основные биохимические свойства ферментов 61
3.2.2 Основные спектральные свойства ферментов 64
3.3 Сравнительные исследования двух множественных форм лакказ базидиомицета trametes pubescens 70
3.3.1 Исследование субстратной специфичности, рН-оптимума и стабильности двух форм лакказ 70
3.3.2 Электрохимические исследования двух форм лакказ 73
3.3.3 Масс-спектроскопические исследования двух форм лакказ 79
3.4 Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиомицета trametes pubescens при деградации модельных соединений лигнина 81
3.4.1 Ионы Мп + - нетрадиционный субстрат лакказы гриба Т. pubescens 81
3.4.2 Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиомицета Trametes pubescens 88
3.5 Разработка амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе частично очищенного препарата культурального фильтрата базидиомицета trametes pubescens 90
ГЛАВА 4. Обсуждение... 96
Выводы 107
Список цитируемой литературы 108
