Введение
Глава 1. Cry-белки Bacillus thuringiensis: молекулярная структура и механизм действия (обзор литературы) 10
1.1. Молекулярная организация Cry-белков 12
1.1.1. Первичная структура, филогенетическое родство, номенклатура 13
1.1.2. Пространствнная организация молекулы Сгу-белков 16
1.1.3. Ограниченный протеолиз Cry- белков 23
1.2. Механизм действия Cry-белков 25
1.2.1. Специфичность инсектицидной активности 25
1.2.2. Общая схема патогенеза 27
1.2.3. Ещё раз об активации протоксинов 29
1.2.4. Связывание Cry-белков с мембранами
кишечного эпителия чувствительных насекомых 30
1.2.5. Токсины В. thuringiensis способны образовывать поры или ионные каналы в искусственных и плазматических мембранах 33
1.2.6. Факторы, вызывающие гибель насекомых 34
1.3. Взаимоотношение структуры и функции в молекулах Cry-белков 36
1.4. Рецепторы Cry-белков в мембранах кишечного эпителия чувствительных насекомых 40
1.4.1. Кадгериноподобный рецептор Cry 1-белков 40
1.4.2. Расположение сайтов связывания с токсинами в молекуле кадгериноподобных белков 43
1.4.3. Элементы структуры Cry-белков, ответственные за связывание с кадгериноподобным рецептором 44
1.4.4. Доказательства участия кадгериноподобных рецепторов в токсическом эффекте Cry-белков in vivo 45
1.4.5. Токсин-связывающие свойства аминопептидазы N 46
1.4.6. Механизм взаимодействия Cry-белков с аминопептидазой N 49
1.4.7. Аминопептидаза N, как кандидат на роль рецептора Cry-белков 52
1.4.8. Другие кандидаты на роль рецептора Cry-белков 54
1.5. Москитоцидные токсины В. thuringiensis 55
Глава 2. Материалы и методы 60
2.1. Выделение дельта-эндотоксинов 60
2.2. Определение концентрации белка 61
2.3. Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков 61
2.4. Выращивание личинок комаров 63
2.5. Определение биологической активности 64
2.6. Методика электронно-микроскопического исследования 64
2.7. Приготовление гистологических препаратов для иммуноцитохимических и цитохимических исследований 65
2.8. Биотинилирование энтомоцидных белков 65
2.9. Проведение гистохимической реакции 66
2.10. Проведение иммуногистохимической реакции 67
2.11. Получение препаратов апикальных мембран
(ВВМ) кишечного эпителия личинок Anopheles stephensi 67
2.12. Синтез аффинных сорбентов 68
2.13. Изучение белкового состава экстрактов мембранных белков, полученных с помощью различных детергентов 69
2.14. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков An. stephensi 69
2.15. Электрофорез 70
2.16. Лиганд-блоттинг 70
2.17. Изучение связывания 65 кДа- и 57 кДа-белков An. stephensi с токсинами В. thuringiensis разной специфичности и продуктами ограниченного протеолиза москитоцидных елков Cryl 1А и Сгу4В 71
2.18. Эксперименты по гомологической и гетерологической конкуренции 71
2.19. Изучение обратимости связывания москитоцидных белков 71
2.20. Определение N-концевой аминокислотной последовательности 72
2.21. Определение активности щелочной фосфатазы 72
Глава 3. Влияние энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis ssp.israelensis и индивидуальных эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А на кишечный эпителий личинок комаров Aedes aegypti 73
3.1. Цели и объекты исследования 73
3.2. Определение диапазона эффективных концентраций кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А 74
3.3. Влияние кристаллов эндотоксина на ультраструктуру кишечного эпителия личинок комара Л. aegypti 78
3.4. Влияние индивидуальных токсинов на ультраструктуру кишечного эпителия личинок комара A. aegypti Ill
Глава 4. Гистохимическое изучение связывания эндотоксина Cryl 1А и активированного токсина Сгу4В с эпителиальными клетками средней кишки личинок комара A. aegypti 142
4.1. Схема эксперимента 143
4.2. Визуализация связывания москитоцидных белков с кишечным эпителием личинок A. aegypti 145
Глава 5. Выделение токсин-связывающих белков из мембран кишечного эпителия личинок An. stephensi 155
5.1. Белковый состав ВВМ кишечного эпителия личинок An. stephensi 155
5.2. Использование лиганд-блоттинга для обнаружения токсин-связывающего белка в экстракте ВВМ An. stephensi 158
5..3. Аффинная хроматография белков ВВМ кишечного эпителия личинок An.stephensi 160
5.4. Взаимодействие 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ
An. stephensi с токсинами Bacillus thuringiensis, обладающими раз личной специфичностью энтомоцидного эффекта 162
5.5. Обратимость связывания 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ An. stephensi с Cry4Box 164
5.6. Гомологическая и гетерологическая конкуренция при взаимо действии эндотоксина Cryl 1А и Cry4Boxс 65 кДа- и 57 кДа-белками 164
5.7. Взаимодействие 65 кДа- и 57 кДа-белков с продуктами ограниченного протеолиза эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А 166
5.8. Определение N-концевой последовательности 57 кДа-белка из ВВМ Ли. stephensi 170
5.9. Определение фосфатазной активности в элюате, содержащем 65 кДа- и 57 кДа-белки из ВВМ An. stephensi 170
5.10. Растворимая форма 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ Ли. stephensi 171
Заключение 173
Выводы 176
Список литературы
