Введение
Обзор литературы 7
I. Системы рестрикции-модификации 7
1.1. Классификация систем рестрикции-модификации прокариот 8
1.1.1. Системы рестрикции-модификации типа 1 9
1.1.2. Система рестрикции-модификации типа III 11
1.1.3. Система рестрикции-модификации типа II 13
1.1.3.1. Ортодоксальный, НЕ и IIF подтипы 15
1.1.3.2. РМ системы подтипа IIS 16
1.1.3.3. РМ системы подтипа IIG 17
1.1.3.4. РМ системы подтипа ПТ 18
1.1.3.5. РМ системы подтипа НВ 19
1.1.3.6. РМ системы подтипа ИМ 20
1.2. Структура эндонуклеаз рестрикции 20
1.3. Механизм гидролиза эндонуклеазами рестрикции фосфодиэфирных связей 23
1.4. Классификация эндонуклеаз рестрикции по способу контроля расщепления ДНК по двум цепям 24
II. ДНК-метилтрансферазы систем рестрикции-модификации типа II 27
II.1. Классификация ДНК-метилтрансфераз 27
II.2. Пространственная структура ДНК-метилтрансфераз 30
II.3. Биологическая роль систем рестрикции-модификации 33
III. Экспериментальная часть 37
III.1. Материалы 37
III.2. Оборудование 42
III.3. Методы 43
III.3.1. Электрофорезы 43
III.3.2. Реакции, использованные в работе 45
III.3.3. Секвенирование ДНК 48
III.3.4. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК
эндонуклеазой рестрикции 49
III.3.5. Приготовление электрокомпетентных клеток 50
III.3.6. Электротрансформация клеток E.coli 51
III.3.7. Щелочное выделение плазмид (мини-преп) 51
III.3.8. Очистка ДНК 52
III.3.9. Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М13 (мини-преп) 53
III.3.10. Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М13 (макси-преп).. 53
III.3.11. Выделение одноцепочечной формы ДНК фага на основе М13 54
III.3.12. Метод кислотной депуринизации 54
III.3.13. Метод тонкослойной хроматографии нуклеиновых оснований 55
III.3.14. Локализация метилцитозина бисульфитным методом (реакция конверсии)... 56
III.3.15. Скрининг штаммов на наличие в них эндонуклеаз рестрикции 56
III.3.16. Получение и очистка лизата клеток для колоночной хроматографии 57
III.3.17. Выделение эндонуклеазы NspLK 58
III.3.18. Выделение эндонуклеазы BspZEl 59
III.3.19. Выделение эндонуклеазы BspLU4 60
III.3.20. Выделение метилаз ВсоША и ВсоКІВ 60
III.3.21. Определение активности эндонуклеаз рестрикции во фракциях 61
III.3.22. Определение функциональной чистоты эндонуклеазы 62
III.3.23. Метод гель-хроматографии 62
III.3.24. Анализ фракций на наличие метилазной активности 62
IV. Результаты и их обсуждение 64
IV. 1. Принцип детектирования эндонуклеаз рестрикции 64
IV.2. Эндонуклеаза рестрикции BspZEl 65
IV.2.1. Выделение эндонуклеазы рестрикции BspZEl 65
IV.2.2. Оптимальные условия работы фермента 68
IV.2.3. Определение активности эндонуклеазы рестрикции BspZEl 68
IV.2.4. Функциональная чистота препарата фермента BspZEl 69
IV.2.5. Определение сайта, узнаваемого эндонуклеазой BspZEl 71
IV.2.6. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой BspZEl 72
IV.2.7. Влияние метилирования dam на расщепление узнаваемого сайта 74
IV.2.8. Сравнение B.species ZE с другими штаммами, содержащими эндонуклеазы- изошизомеры С1а\ 76
IV.3. Эндонуклеаза рестрикции NspLKl 77
IV.3.1. Выделение эндонуклеазы NspLKl 77
IV.3.2. Оптимальные условия работы выделенной эндонуклеазы 78
IV.3.3. Функциональная чистота препарата фермента NspLKl 79
IV.3.4. Определение сайтов узнавания NspLKl 80
IV.3.5. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой NspLKl 81
IV.4. Эндонуклеаза рестрикции ifcpLU41 82
IV.4.1. Определение зависимости содержания эндонуклеазы от фазы роста клеток... 82
IV.4.2. Выделение эндонуклеазы BspL\J4l 83
IV.4.3. Оптимальные условия работы эндонуклеазы BspLU4l 85
IV.4.4. Функциональная чистота препарата BspLU4l 85
IV.4.5. Определение сайта, узнаваемого эндонуклеазой BspL\J4l 86
IV.4.6. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой BspLU4l 87
IV.4.7. Очистка ДНК от эндонуклеазы BspLU4l 88
IV.4.8. Определение молекулярной массы BspL\J4l 88
IV.4.9. Получение «лестниц» молекулярных длин фрагментов ДНК 89
IV.5. Метилазы системы рестрикции-модификации из штамма Bacillus coagulans К 92
IV.5.1. Выделение ДНК-метилтрансфераз 93
IV.5.2. Определение специфичности ДНК-метилтрансфераз 96
IV.5.3. Определение природы основания, метилируемого M.BcoKIA, методом тонкослойной хроматографии 97
IV.5.4. Определение положения метилируемого цитозина 99
IV.5.5. Получение ДНК рекомбинантного фага Ml3tglЗО(ВсоК) 99
IV.5.6. Определение положения в сайте BcoKl метилируемого аденина 102
V. Заключение 109
Выводы 111
Список публикаций по материалам диссертационной работы 112
Цитированная литература 113
