Введение
ГЛАВА 1: Обзор литературы
1.1 Современные представления о нейродегенеративных заболеваниях.
1.1.1 Основные факторы риска развития нейродегенеративных заболеваний 13
1.1.2 Генетическая архитектура нейродегенеративных заболеваний 14
1.2 Молекулярно-генетические методы выявления генов, задействованных в патогенетических механизмах комплексных заболеваний 16
1.2.1 Анализ сцепления локусов количественного признака (QTL)
1.2.2 Полногеномный анализ ассоциаций (GWAS).
1.2.3 Технологии массового параллельного секвенирования транскриптома 21
1.3 Роль метаболического состояния мозга в нейродегенеративных процессах 24
1.4 Общность и различия патогенетических механизмов развития нейродегенеративных
заболеваний в мозге и в сетчатке на примере болезни Альцгеймера (БА) и возрастной
макулярной дегенерации (ВМД) 27
1.4.1 Болезнь Альцгеймера 28
1.4.2 Возрастная макулярная дегенерация 34
1.4.3. Общность происхождения мозга и глаза 36
1.4.4 Эпидемиологические и клинические исследования БА и ВМД 36
1.4.5 Молекулярное сходство между депозитами: друзы и сенильные бляшки 38
1.4.6 Генетические факторы риска развития БА и ВМД 38
1.4.7 Основные молекулярные механизмы, задействованные в патогенезе БА и ВМД 1.4.7.1 Хроническое воспаление с вовлечением системы комплемента 39
1.4.7.2 Активация микроглии 41
1.4.7.3 Ангиогенез 43
1.4.7.4 Окислительный стресс 44
1.4.7.5 Нарушения структуры и функции митохондрий 1.5 Животные модели в свете современных теорий этиопатогенеза Б А 49
1.6 Преждевременно стареющие мыши SAMP8 - биологическая модель БА 50
1.7 Крысы OXYS
1.7.1 История создания линии 51
1.7.2 Функциональные и морфологические особенности крыс OXYS как биологической модели преждевременного старения и связанных с ним заболеваний
Заключение к Главе 1 и постановка задач 57
ГЛАВА 2: Материалы и методы 59
2.1 Материалы, использованные в работе 59
2.2 Животные 59
2.3 Забор, первичная пробоподготовка и хранение биологических образцов 59
2.4 Р -ЯМР-спектроскопическое исследование кислотных экстрактов мозга
2.4.1 Экстракция органических и неорганических фосфатов мозга 60
2.4.2 Р ЯМР-спектроскопический анализ
2.5 Офтальмологические осмотры 61
2.6 Морфологический и морфометрический анализ методом световой микроскопии 62
2.7 Исследование поведения животных в стандартных тестах 2.7.1 Тест «открытое поле» 62
2.7.2 Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» 63
2.7.3 Тест «радиальный восьмирукавный лабиринт»
2.8 Морфометрическое исследование мозга методом магнитно-резонансной томографии 64
2.9 Поиск на 1-й хромосоме генетических локусов, ответственных за развитие у крыс OXYS ранней катаракты, ретинопатии и проявление характерных для этих животных поведенческих признаков
2.9.1 Выделение геномной ДНК из печени крыс методом фенол-хлороформной экстракции..65
2.9.2 Выделение геномной ДНК из хвостов крыс с помощью протеиназы К 66
2.9.3 Полимеразная цепная реакция (ПНР) на геномной ДНК крыс 66
2.9.4 Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) 68
2.9.5 Анализ локусов количественного признака (QTL-анализ) 2.10 Конструирование конгенных линий крыс 69
2.11 Массовое параллельное секвенирование (RNA-seq) на платформе Ulumina 69
2.12 Биоинформатический анализ данных массового параллельного секвенирования 2.12.1 Картирование и анализ дифференциальной экспрессии 71
2.12.2 Функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов 71
2.12.3 Выявление однонуклеотидных полиморфизмов (SNP-calling) 71
2.12.4 Анализ фенотипического эффекта выявленных полиморфизмов (SNP) 72
2.13 Статистический анализ 72
ГЛАВА 3: Результаты 73
3.1 Оценка метаболического состояния мозга крыс методом Р -ЯМР спектроскопии 73
3.2 Идентификация на первой хромосоме локусов, ответственных за проявление комплекса признаков преждевременного старения крыс OXYS 78
3.3 Характеристика конгенных крыс по фенотипическим признакам 81
3.3.1 Заболеваемость животных катарактой и ретинопатией 81
3.3.2 Гистологическое исследование особенностей развития ретинопатии у крыс конгенных линий 83
3.3.3 Признаки ускоренного старения мозга 86
3.3.ЗА Исследование поведения животных 86
3.3.ЗБ Исследование морфофункционалъных параметров мозга крыс 88
3.4 Анализ данных массового параллельного секвенирования (RNA-seq) 91
3.4.1 Картирование конгенных локусов первой хромосомы 91
3.4.2 Сравнительный анализ выявленных несинонимичных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) 94
3.4.3 Анализ секвенирования транскриптома сетчатки крыс 98
3.4.4 Функциональный анализ дифференциально экспрессирующихся генов 103
ГЛАВА 4: Обсуждение результатов 109
4.1 Метаболическое состояние мозга крыс: высокоэнергетические фосфаты 110
4.2 Анализ комплексного признака (QTL-анализ) и экспериментальная проверка его результатов с использованием сконструированных конгенных линий крыс 114
4.3 Картирование конгенных локусов первой хромосомы 118
4.4 Гены-кандидаты, в последовательности кДНК которых у крыс OXYS выявлены несинонимичные однонуклеотидные полиморфизмы относительно крыс WAG 119
4.4.1 Гены-кандидаты, картированные в конгенных локусах первой хромосомы 120
4.4.2 Гены-кандидаты из числа ассоциированных с развитием БА 123
4.5 Сравнительный анализ транскриптома сетчатки крыс конгенных линий и крыс родительской линии OXYS на доклинической стадии развития ретинопатии 125
Заключение 134
Выводы 135
Список литературы 137
