Введение
2. Обзор литературы. Клеточные сигнальные пути в эндотелии 10
2.1. Роль эндотелия в физиологических функциях организма 10
2.1.1. Барьерная роль эндотелия сосудов 10
2.1.2 Роль молекул NF-kB и TLR. в осуществлении эндотелием барьерной функции 11
2.1.3 Роль актинового цитоскелета в осуществлении эндотелием барьерной функции 13
2.1.4. Влияние окислительного стресса на барьерную функцию эндотелия 16
2.2. Адгезивные свойства эндотелия 16
2.2.1. Роль молекулы адгезии РЕСАМ-1 в физиологии клеток эндотелия 17
2.2.2. Роль молекулы адгезии ICAM-1 в физиологии клеток эндотелия 21
2.2.3. Роль молекулы адгезии VCAM-1 в физиологии клеток эндотелия 24
2.2.4. Роль селектинов (в частности, Е-селектина) в физиологии клеток эндотелия 26
2.3. Регуляторная функция эндотелия 29
2.3.1. Синтез и метаболизм N0 29
2.3.2. Роль эндотелиальной NO-синтазы в физиологии эндотелия 32
2.3.3. Роль индуцибельной NO-синтазы в физиологии эндотелия 33
2.3.4. Особенности выработки N0 и экспрессии iNOS и eNOS в клетках культуры эндотелия HUVEC 35
2.3.5. Образование в эндотелии активных форм кислорода и окислительный стресс 35
2.3.6. Апоптотические процессы в клетках эндотелия. Ключевые белки и регуляторы 38
2.3.7. Основные клеточные сигнальные пути, активирующиеся при действии окислительного стресса 39
2.4. Причины и роль дисфункции эндотелия в сердечно-сосудистых, аутоиммунных и других заболеваниях 40
2.5. Действие на клетки фрагментов вкДНК разного состава 41
2.5.1. Содержание циркулирующей ДНК в крови людей в норме и при патологии 41
2.5.2 Структурные особенности вкДНК 43
2.5.3. Микроокружение циркулирующей ДНК 45
2.5.4. ДНК-узнающие рецепторы и их лиганды. Участие TLR-путей в работе клеток эндотелия в норме и при патологии 48
2.6. Заключение по данным литературы 50
3. Материалы и методы 52
3.1. Цитологические методы. Объект исследования 52
3.1.1. Выделение и культивирование клеток эндотелия 52
3.1.2 Добавление к эндотелию фрагментов ДНК 52
3.1.3. Облучение, обработка и инкубирование эндотелия 53
3.1.4. Инкубация клеток с перекисью водорода 53
3.1.5. Культивирование эндотелия для выявления эффекта свидетеля 53
3.1.6. Получение клеточных лизатов 54
3.2. Цитохимические методы 54
3.2.1 Иммуноцитохимическое определение актина 54
3.2.2 Иммуноцитохимическое определение белков TLR9, АІМ2, iNOS, eNOS, peNOS, NOX4, Ki-67, PCNA, p65(NF-kB) 55
3.2.3. Анализ изображений 55
3.2.4. Определение количества АФК методом проточной цитометрии 56
3.2.5. Определение содержания окиси азота в клетках методом проточной цитометрии 56
3.3. Получение и последующее определение свойств внеклеточной ДНК 57
3.3.1. Выделение фрагментов внеклеточной ДНК из среды инкубации эндотелия/ сыворотки крови 57
3.3.2 Получение модельных фрагментов ДНК 58
3.4. Биохимические методы 58
3.4.1. Выделение РНК из эндотелия, определение ее концентрации и хранение 58
3.4.2. Выделение геномной ДНК из эндотелия, определение ее концентрации и хранение 59
3.4.3. Окисление фрагментов ДНК 60
3.4.4 Определение относительного содержания 8-окси-7,8-дигидрогуанозина (8-oxoG) во вкДНК 60
3.4.5. Определение количества метаболитов окиси азота в среде методом Грисса 61
3.4.6 Определение количества метаболитов окиси азота в среде с помощью реагента CuFL 62
3.4.7. Методика ДНК комет (single cell gel electrophoresis) для определения содержания одно- и двунитевых разрывов в клетках HUVEC 62
3.4.8. Детекция двуцепочечных разрывов ядерной ДНК методом иммунофлуоресценции 63
3.5. Молекулярные методы 64
3.5.1 Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 64
3.6. Статистическая обработка 66
4. Результаты и обсуждение 68
4.1. Общая схема эксперимента 68
4.2. Характеристика образцов ДНК 68
4.2.1. Лиганды и ингибиторы TLR9 69
4.2.2. Окисленные формы ДНК 71
4.2.3. Характеристика циркулирующей ДНК плазмы человека в норме, при патологии и внешнем воздействии (ионизирующее излучение) 72
4.3. Локализация образцов экзогенной ДНК с различными свойствами в клетках HUVEC 74
4.4. Влияние GC-ДНК и ДНК0Х на экспрессию TLR9 76
4.4.1. Изменения количества мРНК TLR9 76
4.4.2. Изменения количества белка TLR9 79
4.5. Влияние GC-ДНК и ДНКох на экспрессию других ДНК-сенсоров 82
4.6. Изменение уровня АФК в HUVEC при действии различных образцов ДНК 85
4.6.1. Детекция количества АФК в HUVEC различными методами 85
4.6.2. Свойства вкДНК влияют на количество АФК в HUVEC 88
4.7. Свойства вкДНК влияют на количество мРНК N0X4 в HUVEC 93
4.8. Свойства вкДНК влияют на количество мРНК SOD1 в HUVEC 97
4.9. Изменение свойств вкДНК стимулирует образование разрывов геномной ДНК в клетках HUVEC 98
4.9.1. Анализ разрывов ДНК ядер HUVEC методом комет 98
4.9.2.Анализ разрывов ДНК ядер методом иммунофлуоресценции 101
4.10. Изменение свойств вкДНК приводит к нестабильности генома 105
4.11. Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию клеток HUVEC.. 109
4.12. Изменение свойств вкДНК влияет на уровень гибели клеток HUVEC. 115
4.13. Изменение свойств вкДНК влияет на количество окиси азота в HUVEC 117
4.14. Изменение уровня экспрессии и полимеризации актина 125
4.15. Изменение адгезивных свойств HUVEC при изменении свойств вкДНК127
4.16. Активация транскрипционного фактора NF-kB при изменении свойств вкДНК 130
4.16.1. Изменение количества мРНК основных генов пути, контролирующего транскрипционный фактор NF-kB, при изменении свойств вкДНК среды культивирования HUVEC 130
4.16.2. Изменение количества белка р65 и локализации его в клетках при изменении свойств вкДНК 132
5. Заключение 137
6. Выводы 141
Список сокращений и условных обозначений 143
Список литературы 144
