Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Ориджины репликации эукариот 12
1.1.1. Процесс инициации репликации на ориджине 12
1.1.2. Последовательности ДНК в районах ориджинов репликации 14
1.1.3. Методы картирования ориджинов репликации в геномах эукариот
1.1.3.1. Метод иммунопреципитации хроматина 17
1.1.3.2. Метод двумерного гель-электрофореза 18
1.1.3.3. Анализ коротких новосинтезированных нитей ДНК 20
1.1.3.4. Bubblerap метод 21
1.1.3.5. Картирование точек старта репликации на уровне отдельных нуклеотидов
1.1.3.6. Метод молекулярного комбинга 24
1.1.4. Эффективность ориджинов репликации 25
1.1.5. Локализация ориджинов репликации в промоторах генов и их регуляция 27
1.1.5.1. Участие комплексов ремоделинга хроматина в регуляции ориджинов
репликации 28
1.1.5.2 Участие факторов транскрипции в регуляции ориджинов репликации 29
1.1.6. Механизмы регуляции ориджинов репликации, расположенных в районах гетерохроматина 31
1.1.7. Модификации гистонов в районах ориджинов репликации
1.1.7.1. Ацетилирование гистонов стимулирует активность ориджинов 33
1.1.7.2. Метилирование Н4К20 участвует в регуляции лицензирования ориджинов репликации 1.1.8. Влияние CpG островков и уровня их метилирования на активность ориджинов репликации 36
1.1.9. Пространственная организация репликации в ядре. Фокусы репликации 37
1.1.10 Ассоциация ориджинов репликации с ядерным матриксом 38
1.1.11. Регуляция ориджинов репликации в процессе эмбрионального развития и дифференцировки клеток 41
1.1.12. Регуляция временной картины репликации генома. Репликационные домены45
1.2. Центр инактивации Х-хромосомы 49
1.2.1. Структура центра инактивации Х-хромосомы мыши и полевки 49
1.2.2. Ориджины репликации центра инактивации Х-хромосомы мыши 50
1.2.3. Модификации хроматина в центре инактивации Х-хромосомы мыши 55
ГЛАВА 2. Материалы и методы 59
2.1. Материалы
2.1.1. Культуральные среды, сыворотки, антибиотики, добавки 59
2.1.2. Ферменты 59
2.1.3. Реактивы 59
2.1.4. Растворы и буферы 60
2.1.5. Наборы 2.2. Объект исследования 61
2.3. Методы 62
2.3.1. Методы работы с клеточными культурами 62
2.3.1.1. Состав культуральных сред и условия культивирования 62
2.3.1.2. Замораживание клеток 63
2.3.1.3. Размораживание клеток
2.3.2. Получение нсДНК из асинхронно делящейся культуры клеток 63
2.3.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер клеток 64
2.3.4. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 65
2.3.5. Вестерн блот-гибридизация 65
2.3.6. Иммунопреципитация хроматина (ChIP) 66
2.3.7. Выделение РНК 69
2.3.8. Синтез кДНК методом обратной транскрипции 69
2.3.9. Подбор праймерных пар 2.3.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 72
2.3.11. ПЦР в реальном времени 73
2.3.12. Электрофорез ДНК в агарозном геле 74
2.3.13. Выделение фрагментов ДНК из гелей 74
2.3.14. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 75
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 76
3.1. Картирование ориджинов репликации в центре инактивации Х-хромосомы самцов
полевки М. levis 76
3.1.1. Картирование активных ориджинов репликации методом NSАА в ТС клетках, клетках XEN и фибробластах самцов полевкиМ levis 76
3.1.2. Локализация сайтов связывания ORC в локусе XIC в фибробластах самцовМ. levis 83
3.2. Анализ нуклеотидного состава ориджинов репликации в локусе XIC М. levis 87
3.3. Анализ ассоциации ориджинов репликации с G4 мотивами 88
3.4. Статус экспрессии генов в локусе XIC в фибробластах самцовМ. levis 91
3.5. Распределение гистона НЗ и его варианта НЗ. З в локусе XIC М. levis 92
3.6. Модификации хроматина в локусе ХІС в фибробластах самцовМ. levis. Паттерн ацетилирования НЗК9, монометилирования Н4К20 и триметилирования НЗК27 95
3.7. Сравнение расположения ориджинов репликации в локусах XIC 101
М. musculus иМ levis 101
Заключение 104
Выводы 106
Список литературы 1
