Введение
2. Обзор литературы 11
2.1 Структурная организация хроматина 11
2.1.1. Начальные уровни компактизации хроматина: 11
нуклеосомы и элементарная фибрилла хроматина
2.1.2. Высшие уровни организации хроматина 17
2.1.3. Роль ядерного матрикса и хромосомного скэффолда в формировании пелевых доменов хроматина
2.1.4. ДНК-белковые взаимодействия, определяющие петлевую организацию генома
2.1.5. Высшие уровни организации хроматина в интактных клетках
2.1.6. Линейная неоднородность митотических хромосом
2.2. Структура и функция конденсинов 47
2.2.1. Семейство SMC-белков 50
2.2.2. Функции конденсинов в митозе 51
2.2.3. Биохимические активности конденсинов 53
2.2.4. Взаимодействие конденсинов с ДНК.
2.2.5. Конденсины и компактизация хромосом. 57
2.2.6. Взаимодействие топоизомеразы II и конденсина в митотических хромосомах
2.2.7. Фосфорилирование и регуляция конденсинов 62
2.2.8. Роль регуляторных субъединиц конденсина в связывании с хромосомами
2.2.8. Другие факторы, участвующие в рекрутировании конденсинов
2.2.9. Взаимодействие субъединиц в составе конденсинового комплекса
2.2.10. Роль конденсинов в регуляции транскрипции 71
2.3. Структурная организация реплицирующегося хроматина 76
2.3.1. Домены хроматина и репликация 76
2.3.1. Репликативная организация нативного хроматина: репликативные сайты
2.3.2. Ультраструктура репликационного сайта 87
2.4. Структурная организация хроматина и регуляция транскрипции
2.4.1. Регуляция транскрипции на уровне нуклеосом 97
2.4.2. Петлевые домены и транскрипция 99
2.4.3. Пространственная организация транскрипции: транскрипционные фабрики
2.4.4. Роль хроматиновых фибрилл высшего порядка в регуляции транскрипции
2.4.5. Взаимосвязь транскрипционной активности генов с пространственной организацией интерфазного ядра: хромосомные территории
2.4.6. Регуляция транскрипции в масштабах целой хромосомы: инактивация Х-хромосомы
Цели и задачи работы 114
3. Материлы и методы 116
3.1. Растворы 116
3.2. Векторы и их модификация 117
3.3. Культура клеток 119
3.4. Синхронизация клеток 120
3.5. Получение трансгенных клеточных линий 123
3.6. Ингибирование транскрипции 123
3.7. Световая микроскопия и иммунофлуоресценция 124
3.8. Визуализация реплицированного хроматина 126
3.9. Получение хромосомных препаратов и дифференциальная окраска хромосом
3.10. Прижизненные наблюдения за клетками 12 8
3.11. Электронная микроскопия 128
3.12. Иммуноэлектронная микроскопия 129
3.13. Цифровая обработка изображения 13 0
3.14. In vivo иммуномечение ядерных белков 131
3.15. Гибридизация in situ 132
3.16. Определение копийности интегрированных трансгенных конструкций
3.17. Выделение РНК и РТ-ПЦР 134
3.18. Получение препаратов мейотических хромосом Xenopus laevis и иммуноокрашивание
3.19. Электрофорез и иммуноблоттинг 137
4. Результаты и их обсуждение 138
4.1. Структурные мотивы высшего порядка в организации факультативного гетерохроматина
4.1.1. Идентификация неактивной Х-хромосомы на светооптическом и электронномикроскопическом уровне
4.1.2. Ультраструктурная организация неактивной Х- хромосомы.
4.1.3. ЗБ-структура тельца Барра. 151
4.1.4. Позиционирование неактивной Х-хромосомы в ядре.
4.2. Динамика структурной организации хроматина в процессе репликации
4.2.1. Визуализация репликативных сайтов в контексте интактного хроматина.
4.2.2. Пост-репликативная реорганизации хроматина 171
4.2.3. Ультраструктура хроматина в сайтах репликации 175
4.2.4. Топология реплисом в реплицирующемся хроматине
4.3. Особенности структурной организации рано- и позднореплицирующихся доменов хроматина в составе митотических хромосом .
4.4. Динамика высших уровней организации хроматина при активации транскрипции.
4.4.1. Создание трансгенных клеточных линий с множественные копии бактериальных искусственных хромосом, содержащих локусы DHFR, МТ и Hsp70.
4.4.2. Индукция транскрипции в трансгенных локусах. 220
4.4.3. Изменения степени компактизации высших уровней организации хроматина при индукция транскрипции.
4.4.4. При ингибровании транскрипции деконденсация высших уровней упаковки хроматина блокируется или существенно ослабляется.
4.4.5. Тепловой шок стимулирует ассоциацию трансгена Hsp70 с кластерами интерхроматиновых гранул.
4.4.6. Подвижность транскрипционно-активных локусов 2 4.5. Высшие уровни упаковки хроматина, выявляемые в ходе 250 естественной компактизации хромосом в митозе.
4.6. Роль ионов Са в стабилизации высших уровней 262 компактизации ДНК
4.7. Динамика рекрутирования и хромосомная локализация 273
конденсинов в ходе профазной компактизации хромосом.
4.8. Исследование поведения конденсинов при искусственном 287
изменении степени компактизации хромосом в живых клетках
4.8.1, Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках при искусственной декомпактигации хромосом в условиях обратимого гипотонического шока.
4.8.2. Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках после воздействия цитостатиков.
4.9. Конденсировый комплекс в мейозе. 296
4.9.1. Ядерная локализация конденсинов в профазе мейозаI
4.9.2. Дифференциальная ассоциация субъединиц конденсинов с профазными мейотическими хромосомами
4.9.3. Независимое рекрутирование субъединиц 304
конденсинового комплекса в нехроматиновые домены
ядра.
5. Заключение 313
6. Выводы 321
7. Благодарности 324
8. Список цитированной литературы
