ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................. 5
Актуальность темы исследования.................................................................................................... 5
Степень разработанности темы ........................................................................................................ 6
Цели и задачи ..................................................................................................................................... 7
Научная новизна ................................................................................................................................ 7
Теоретическая и практическая значимость работы ....................................................................... 8
Методология и методы исследования ............................................................................................. 9
Положения, выносимые на защиту .................................................................................................. 9
Степень достоверности и апробация результатов .......................................................................... 9
Публикации ...................................................................................................................................... 10
Личный вклад автора....................................................................................................................... 11
Структура диссертации ................................................................................................................... 11
Финансовая поддержка и благодарности ...................................................................................... 12
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................................... 13
1.1. Бактерии и стратегии их выживания в организме человека ..................................................... 13
1.1.1. Эпидемиология бактериальных заболеваний и их роль в индукции опухолей .............. 13
1.1.2. Роль бактерий Serratia в развитии инфекционных процессов .......................................... 14
1.1.3. Механизмы инвазии бактерий в эукариотические клетки ................................................ 16
1.1.4. Роль везикул наружной мембраны бактерий в патогенезе ............................................... 19
1.1.5. Роль систем секреции во взаимодействии бактерий с эукариотическими клетками ..... 21
1.1.6. Бактериальные факторы, участвующие в поглощении ионов железа .............................. 23
1.2. Структурные компоненты эукариотической клетки, участующие в инвазии бактерий ........ 26
1.2.1. Цитоплазматическая мембрана ............................................................................................ 26
1.2.2. Цитоскелет ............................................................................................................................. 30
1.2.3. Рецепторы клеточной адгезии .............................................................................................. 35
1.3. Иммунный ответ организма-хозяина на бактериальное заражение ......................................... 42
1.3.1. Антибактериальный врожденный иммунитет .................................................................... 42
1.3.2. Цитокины: интерлейкин-6 (ИЛ-6) и интерлейкин-8 (ИЛ-8).............................................. 47
1.3.3. Продукция ИЛ-6 и ИЛ-8 эпителиальными клетками в ответ на бактериальную инфекцию ......................................................................................................................................... 50
1.3.4. Нейтрофилы, их строение и функции.................................................................................. 52
1.3.5. Миелопероксидаза ................................................................................................................. 54
1.3.6. Лактоферрин и его комплексы ............................................................................................. 55
3
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................................................ 59
2.1. Эукариотические клетки ............................................................................................................... 59
2.1.1. Культуры клеток и условия культивирования .................................................................... 59
2.1.2. Подсчет клеток в камере Горяева и определение их жизнеспособности ........................ 60
2.1.3. Измерение цитотоксического действия лактоферрина и его комплексов ....................... 61
2.1.4. Временная трансфекция миРНК .......................................................................................... 61
2.2. Бактериальные клетки................................................................................................................... 62
2.2.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования ........................................................ 62
2.2.2. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам............................................... 62
2.2.3. Выявление актиназной активности бактериальных протеаз ............................................. 64
2.2.4. Выделение везикул наружной мембраны бактерий Serratia ............................................. 64
2.2.5. Измерение дзета-потенциала бактериальных клеток ........................................................ 65
2.2.6. Определение концентрации ионов железа в бактериальной КЖ ..................................... 65
2.2.7. Измерение цитотоксического действия лактоферрина и его комплексов ....................... 66
2.3. Метод количественной оценки инвазии ..................................................................................... 66
2.4. Анализ продукции цитокинов ...................................................................................................... 67
2.4.1. Подготовка проб в процессе инвазии бактерий ................................................................. 67
2.4.2. Подготовка проб после инвазии бактерий .......................................................................... 67
2.4.3. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) цитокинов ........................................ 68
2.5. Анализ концентрации ионов кальция в эукариотических клетках .......................................... 69
2.6. Электрофоретические методы ..................................................................................................... 70
2.6.1. SDS диск-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в щелочной системе ......... 70
2.6.2. Зимография............................................................................................................................. 70
2.6.3. Вестерн-блот анализ .............................................................................................................. 71
2.7. Конфокальная микроскопия ......................................................................................................... 72
2.8. Сканирующая электронная микроскопия ................................................................................... 73
2.9. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени .................................................................................................................................................. 73
2.10. Статистическая обработка результатов .................................................................................... 74
3. РЕЗУЛЬТАТЫ .................................................................................................................................. 75
3.1. Сравнение бактериальных штаммов ........................................................................................... 75
3.1.1. Зависимость инвазии бактерий от времени культивирования .......................................... 75
3.1.2. Зависимость количества внутриклеточных бактерий от времени инвазии ..................... 77
3.1.3. Зависимость количества внутриклеточных бактерий от множественности заражения . 78
4
3.1.4. Зависимость инвазии S. grimesii и S. proteamaculans от предварительной обработки клеток бактериальными везикулами или энтеробактериями ........................................................... 79
3.1.5. Устойчивость к антибиотикам ............................................................................................. 81
3.2. Участие белков клеточной адгезии – интегринов и кадгеринов – эпителиальных клеток в процессе интернализации бактерий ................................................................................................... 82
3.3. Участие микродоменов клеточной мембраны эукариотических клеток в инвазии бактерий ................................................................................................................................................ 90
3.4. Роль цитоскелета в инвазии бактерий Serratia ......................................................................... 102
3.5. Анализ функциональной активности эпителиальных клеток при бактериальной инвазии ............................................................................................................................................... 109
3.6. Действие белков нейтрофилов – лактоферрина и миелопероксидазы – на инвазию бактерий .............................................................................................................................................. 118
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ................................................................................................. 128
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ .............................................................................................................................. 141
ВЫВОДЫ ............................................................................................................................................ 144
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................................ 145
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................................. 147
