Введение
1. Литературный обзор 12
1.1. Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий 12
1.1.1. Особенности структуры цитоплазматической и наружной мембран 12
1.2. Влияние факторов окружающей среды на липидный состав бактерий 15
1.3. Порины 26
1.4. Липид-белковые взаимодействия и конформация белков 29
1.5. Взаимосвязь между белками внешней мембраны, липидами и антибиотикорезистетностью грамотрицательных бактерий 36
2. Материалы и методы 44
2.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования 44
2.2. Получение фракций наружной и внутренней мембран Yersinia pseudotuberculosis 45
2.3. Идентификация фракций наружной и внутренней мембран 46
2.3.1. Фото- и рефрактометрия мембранных фракций, полученных в результате равновесного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы 46
2.3.2. Электрофоретическое разделение белков мембранных фракций, полученных после равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы 47
2.3.3. Вестерн-блоттинг мембранных фракций, полученных в результате ультрацентрифугирования 47
2.4. Экстракция липидов 48
2.5. Тонкослойная хроматография
2.5.1. Приготовление пластинок 48
2.5.2. Системы растворителей для тонкослойной хроматографии липидов 49
2.5.3. Обнаружение липидов
2.6. Количественное определение фофолипидов 49
2.7. Препаративное выделение фосфолипидов 50
2.8. Анализ состава жирных кислот общих липидов Y. pseudotuberculosis 50
2.9. Исследование фазовых переходов общих липидов Y. pseudotuberculosis 51
2.10. Подготовка липид-белковых комплексов для калориметрических,
спектроскопических исследований, ДСН-ПААГ-электрофореза и вестерн блоттинга 52
2.11. Калориметрическое исследование термоденатурации порина 53
2.12. Исследование собственной флуоресценции порина 53
2.13. ДСН-ПААГ-электрофорез и вестерн-блоттинг порина 54
2.14. Исследование влияния экстракта полифенолов из шелухи гречихи на резистентность Y. pseudotuberculosis к ампициллину 55
2.14.1. Определение минимальной ингибирующей концентрации ампициллина для Y. pseudotuberculosis 56
2.15. Анализ уровня экспрессии pldА, ompF и ompC в зависимости от состава культуральной среды 56
3.1. Влияние стресс-индуцированных изменений в липидах Y. pseudotuberculosis на конформацию порина OmpF 59
3.1.1. Влияние фенола на фосфолипидный и жирнокислотный состав общих липидов Y. pseudotuberculosis 59
3.1.2. Влияние фенольной обработки на термотропное поведение общих липидов Y. pseudotuberculosis 62
3.1.3. Влияние аккумуляции лизофосфатидилэтаноламина в липидах Y. pseudotuberculosis на конформацию порина OmpF 63
3.1.3.1. Дифференциальная сканирующая калориметрия порина 63
3.1.3.2. Собственная флуоресценция порина 67
3.2. Жирнокислотный состав лизофосфатидилэтаноламина и фосфатидилэтаноламина из клеток Y. pseudotuberculosis, обработанных фенолом .72
3.3. Влияние ФЭ, насыщенной и ненасыщенной форм ЛФЭ на конформацию порина YOmpF 73
3.3.1. Дифференциальная сканирующая калориметрия порина 73
3.3.2. Собственная флуоресценция порина 76
3.3.3. Вестерн-блоттинг 78
3.4. Эффект повышения температуры роста и теплового шока на липидный состав внутренней и наружной мембран Y. pseudotuberculosis 81
3.4.1. Идентификация фракций, обогащенных наружной и цитоплазматической мембранами 83
3.4.2. Фосфолипидный состав цитоплазматической и наружной мембран и целых клеток Y. pseudotuberculosis, выращенных при разных температурах или подвергнутых тепловому шоку 85
3.4.3. Влияние температуры культивирования и теплового шока на жирнокислотный состав липидов цитоплазматической и наружной мембран Y.pseudotuberculosis 88
3.5. Влияние уровня ЛФЭ на чувствительность Y. pseudotuberculosis к ампициллину 92
3.5.1. Характеристика экстракта полифенолов из шелухи гречихи 94
3.5.2. Влияние глюкозы и экстракта полифенолов из гречихи на фосфолипидный состав Y. pseudotuberculosis 94
3.5.3. Влияние глюкозы и экстракта полифенолов из шелухи гречихи на уровень экспрессии генов фосфолипазы А наружной мембраны и неспецифических поринов (OmpF и OmpС) в клетках Y. pseudotuberculosis 95
3.5.4. Исследование чувствительности к ампициллину клеток Y. pseudotuberculosis в зависимости от присутствия глюкозы и экстракта полифенолов из шелухи гречихи в культуральной среде 98
Выводы 100
Список литературы 102
