Введение
2. Обзор литературы 21
2.1. Ааптаминовые алкалоиды 21
2.1.1. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из природных источников 21
2.1.2. Биологическая активность ааптаминовых алкалоидов 26
2.1.3. Цитотоксическая активность ааптаминовых алкалоидов по отношению к опухолевым клеткам 2.2. Тритерпеновые гликозиды голотурий 30
2.3. Педерины, оннамиды и микаламиды 33
2.4. «Двухголовые» сфинголипиды морских губок 36
2.5. Гуанидиновые алкалоиды морской губки Monanchora pulchra 38
2.6. JB6 P+ Cl41 клетки как модель для изучения канцер-превентивных веществ 42
2.7. Герминальные опухолевые клетки
2.7.1. Аберрантное развитие и опухоли половых клеток 43
2.7.2. Цисплатин-устойчивые клеточные линии GCT 2.8. Рак простаты 45
2.9. Лимфома Бёркитта
2.10. Рак мочевого пузыря 49
2.11. Апоптоз
2.11.1. Каспаза-зависимый апоптоз 50
2.11.2. Каспаза-независимая клеточная смерть 2.12. Аутофагия 54
2.13. Исследование эффекта комбинации препаратов 57
2.14. Протеомика и методы, применяемые в ней 58
3. Обсуждение результатов 60
3.1. Исследование ааптаминовых алкалоидов морской губки Aaptos sp. 60
3.1.1. Выделение и установление химического строения ааптаминовых алкалоидов из губки Aaptos sp 60
3.1.2. Изучение противоопухолевой in vitro активности и механизмов действия выделенных алкалоидов ааптаминового ряда
3.1.2.1. Цитотоксическая активность 67
3.1.2.2. Канцер-превентивная активность ааптаминовых алкалоидов 68
3.1.2.3. Влияние исследуемых алкалоидов на фосфорилирование МАРК ERKs 70
3.1.2.4. Исследование влияния алкалоидов ааптаминового ряда на AP-1-, NF-кВ- и р53-зависимую транскрипционную активность 71
3.1.2.5. Исследование влияния ааптамина на NT2 опухолевые клетки человека
3.1.2.5.1. Влияние ааптамина на способность к пролиферации и жизнеспособность NT2 опухолевых клеток человека 77
3.1.2.5.2. Исследование про-апоптотической активности ааптамина 78
3.1.2.5.3. Исследование влияния ааптамина на клеточный цикл в NT2 клетках 80
3.1.2.5.4. Выявление белков, регулируемых под действием нецитотоксических концентраций ааптамина в NT2 клетках 81
3.1.2.5.5. Исследование белков, регулируемых под действием ааптамина в NT2 клетках 3.1.2.5.5.1. Анализ экспрессии соответствующих генов 83
3.1.2.5.5.2. Анализ экспрессии белков методами Вестерн-блоттинга и 2D-Вестерн-блоттинга 85
3.1.2.5.5.3. Исследование изменений, происходящих с белком eIF5A
3.1.2.5.5.3.1. Доказательство увеличения экспрессии гипузинированной формы белка eIF5A под действием ааптамина наЖ2 клетки 89
3.1.2.5.5.3.2. Эксперимент по включению 3Н-спермидина 91
3.1.2.5.5.3.3. Исследование влияния ааптамина на уровень содержания ферментов DHS и DOHH в NT2 клетках 92
3.1.2.5.5.3.4. Исследование влияния ааптамина на активность фермента DHS in vitro 93
3.1.2.5.5.3.5. Исследование влияния сверхэкспрессии деоксигипузинсинтазы (DHS) на скорость пролиферации NT2 клеток 95
3.1.2.5.5.3.6. Исследование эффекта ингибитора протеасом MG-132 на процесс гипузинирования белка eIF5A в NT2 клетках 97
3.1.2.5.6. Обсуждение результатов исследования белков, регулируемых под действием ааптамина в NT2 клетках 98
3.1.2.6. Механизмы канцер-превентивного и цитотоксического действия ааптамина 101
3.1.2.7. Исследование действия ааптаминовых алкалоидов на цисплатин-устойчивые опухолевые клетки NT2-R 101
3.1.2.7.1. Сравнение действия ааптаминовых алкалоидов на цисплатин чувствительные NT2 и цисплатин-устойчивые NT2-R опухолевые клетки 101 3.1.2.7.2. Изучение индукции апоптоза ааптамином, деметилоксиааптамином и изоааптамином в NT2-R клетках 103
3.1.2.7.3. Выявление белков, регулируемых в NT2-R клетках под действием ааптамина 105
3.1.2.7.4. Выявление белков, регулируемых в NT2-R клетках под действием деметилоксиааптамина 109
3.1.2.7.5. Белки, регулируемые в NT2-R клетках под действием изоааптамина 112
3.1.2.7.6. Обсуждение результатов экспериментов по действию ааптаминовых алкалоидов на цисплатин-чувствительные (NT2) и цисплатин-устойчивые опухолевые клетки (NT2-R) 115
3.2. Исследование микаламида А из асцидии Polysincraton sp. 119
3.2.1. Выделение и установление структуры микаламида А из морской асцидии Polysincraton sp. 119
3.2.2. Исследование противоопухолевой in vitro активности и механизмов действия микаламида А in vitro
3.2.2.1. Исследование способности микаламида А предотвращать EGF-индуцируемую злокачественную трансформацию клеток JB6 P+ Cl41 и колонеобразование опухолевых клеток HeLa 120
3.2.2.2. Апоптоз-индуцирующая активность микаламида А 121
3.2.2.3. Эффект микаламида А на транскрипционную активность ядерных факторов AP-1, NF-B и p53 в клетках JB6 Cl41 123
3.2.2.4. Исследование влияния микаламида А на MAPK p38, JNK1/2 и ERK1/2 125
3.2.2.5. Обсуждение результатов исследования биологической активности микаламида А 126
3.3. Исследование противоопухолевой in vitro активности гуанидиновых алкалоидов морской губки Monanchora pulchra 127
3.3.1. Исследование цитотоксической активности и механизмов действия монанхоцидина А (Mc-A) на моделях лекарственно-устойчивых герминальных опухолевых клеток 127
3.3.1.1. Исследование цитотоксической активности Mc-A 127
3.3.1.2. Эффект Mc-A на прогрессию клеточного цикла и экспрессию маркеров апоптоза в опухолевых клетках 130
3.3.1.3. Индукция неспецифической белковой деградации под действием Mc-A на опухолевые клетки 133
3.3.1.4. Индукция цитотоксической аутофагии опухолевых клеток NCCIT-R под действием Mc-A 136
3.3.1.5. Индукция пермеабилизации лизосомных мембран (ПЛМ) под действием McA на опухолевые клетки 140
3.3.1.6. Обсуждение результатов исследования in vitro цитотоксической активности Mc-A на опухолевые клетки человека 142
3.3.1.7. Исследование эффекта Mc-A на протеом клеток NCCIT-R
3.3.1.7.1. Выявление белков, регулируемых под действием Mc-A в клетках NCCIT-R 145
3.3.1.7.2. Биоинформатический анализ протеомных данных 150
3.3.1.7.3. Валидация регулируемых белков, открытых методом протеомики 153
3.3.1.7.4. Валидация предсказанного ингибирующего эффекта Mc-A на миграцию и колонеобразование клеток NCCIT-R 156
3.3.1.7.5. Обсуждение результатов анализа эффекта Mc-A на протеом клеток NCCIT- 160
3.3.2. Исследование in vitro канцер-превентивной и цитотоксической активности
гуанидиновых алкалоидов губки Monanchora pulchra на клетках JB6 Cl41 и HeLa 163
3.3.2.1. Исследование in vitro канцер-превентивной активности гуанидиновых алкалоидов губки Monanchora pulchra 163
3.3.2.2. Исследование эффекта алкалоидов 59, 60, 65-68, 71 и 75 на MAPK/AP-1 сигналинг 166
3.3.2.3. Исследование эффекта гуанидиновых алкалоидов на транскрипционную активность белка p53 171
3.3.2.4. Эффект алкалоидов 59, 60, 65-68, 71 и 75 на индукцию программируемой клеточной смерти, а также ареста клеточного цикла опухолевых клеток HeLa 172
3.3.2.5. Обсуждение результатов исследования in vitro канцер-превентивной и цитотоксической активности гуанидиновых алкалоидов губки Monanchora pulchra 175
3.4. Исследование противоопухолевоой активности тритерпенового гликозида
фрондозида А (FrA) из кукумарии Cucumaria okhotensis 179
3.4.1. Исследование активности FrA на моделях рака простаты 179
3.4.1.1. Исследование эффекта FrA на жизнеспособность, способность к пролиферации, а также колонеобразование клеток рака простаты 179
3.4.1.2. Эффект FrA на прогрессию клеточного цикла и индукцию апоптоза клеток рака простаты 182 3.4.1.3. Эффект FrA на экспрессию некоторых про- и анти-апоптотических белков в клетках рака простаты 185
3.4.1.4. Эффект FrA на цитопротекторную аутофагию в клетках рака простаты 187
3.4.1.5. Выявление белков, регулируемых в клетках PC-3 под действием цитотоксических концентраций FrA, с помощью методов протеомики 191
3.4.1.6. Анализ экспрессии открытых с помощью 2D-PAGE белков методами Вестерн-блоттинга и 2D-Вестерн-блоттинга 194
3.4.1.7. Анализ возможных взаимодействий регулируемых под действием FrA белков 195
3.4.1.8. In vivo активность FrA на моделях рака простаты человека 196
3.4.1.8.1. Эффект FrA на рост первичных опухолей и формирование метастазов 196
3.4.1.8.2. Исследование побочных эффектов применения FrA in vivo 199
3.4.1.9. Обсуждение результатов экспериментов по воздействию FrA на опухолевые клетки рака простаты человека 201
3.4.2. Исследование активности FrA на моделях уротелиальной карциномы человека 205
3.4.2.1. Исследование эффекта FrA на жизнеспособность клеток уротелиальной карциномы человека 205
3.4.2.2. Исследование апоптоз-индуцирующего эффекта FrA в клетках уротелиальной карциномы человека 205
3.4.2.3. Исследование роли каспаз и в FrA-индуцируемом апоптозе 206
3.4.2.4. Исследование эффекта FrA на MAPK в клетках RT112 209
3.4.2.5. Исследование эффект FrA на аутофагию в клетках уротелиальной карциномы 210
3.4.2.6. Исследование комбинированного действия FrA с цисплатином или гемцитабином на клетках уротелиальной карциномы человека 213
3.4.2.7. Обсуждение результатов исследования эффекта FrA на клетки уротелиальной карциномы человека 213
3.4.3. Исследование активности FrA на моделях лимфомы Бёркитта 216
3.4.3.1. Исследование эффекта FrA на жизнеспособность клеток лимфомы Бёркитта 216
3.4.3.2. Эффект FrA на прогрессию клеточного цикла клеток лимфомы Бёркитта 216
3.4.3.3. Исследование способности FrA индуцировать каспаза-независимый апоптоз клеток лимфомы Бёркитта 218
3.4.3.4. Исследование эффекта FrA на митохондрии и транслокацию AIF в клеточное ядро 221 3.4.3.5. Исследование роли белка p53 в FrA-индуцируемом апоптозе клеток лимфомы Бёркитта 223
3.4.3.6. Эффект FrA на аутофагию в клетках лимфомы Бёркитта 224
3.4.3.7. Обсуждение результатов исследования активности FrA на моделях лимфомы Бёркитта 225
3.5. Исследование противоопухолевой активности ризохалинина (Rhiz) на моделях
рака простаты человека 228
3.5.1. Исследование эффекта Rhiz in vitro 228
3.5.1.1. Исследование способности Rhiz ингибировать жизнеспособность клеток рака простаты человека 228
3.5.1.2. Исследование апоптоз-индуцирующей активности Rhiz в клетках рака простаты человека 229
3.5.1.3. Исследование эффекта Rhiz на аутофагию в клетках рака простаты 233
3.5.1.4. Исследование эффекта Rhiz на потенциал-зависимые калиевые каналы 237
3.5.1.5. Эффект Rhiz на AR-сигналинг в клетках рака простаты 240
3.5.1.6. Исследование эффекта Rhiz в комбинации с доцетакселем и кабазитакселем, а также с энзалутамидом при действии на AR-V7-положительные клеткам 242
3.5.2. Исследование эффекта Rhiz in vivo 243
3.5.2.1. Подбор дозы Rhiz для испытаний in vivo 243
3.5.2.2. Эффект на Rhiz рост первичных опухолей и индукцию апоптоза опухолевых клеток in vivo 244
3.5.2.3. Исследование побочных эффектов Rhiz in vivo 247
3.5.3. Обсуждение результатов исследования противоопухолевоой активности Rhiz на
моделях рака простаты человека 248
4. Экспериментальная часть 252
4.1. Приборы и материалы 252
4.1.1. Приборы 252
4.1.2. Реагенты 252
4.1.3. Клеточные культуры 255
4.1.4. Выделение и синтез исследуемых веществ
4.1.4.1. Общая информация 257
4.1.4.2. Биологический материал для выделения ааптаминовых алкалоидов и микаламида А 258
4.1.4.3. Поиск и выделение ааптамина и его производных 258
4.1.4.3.1. Скрининг губок 258
4.1.4.3.2. Выделение ааптаминовых алкалоидов 261
4.1.4.3.2.1. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из губки Aaptos sp.l 261
4.1.4.3.2.2. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из губки Aaptos sp.2 262
4.1.4.3.3. Восстановление 3-(#-морфолинил)-деметилоксиааптамина (78) 263
4.1.4.4. Выделение микаламида А 263
4.2. Стандартные методики для определения биологической активности веществ 264
4.2.1. Определение цитотоксической активности веществ методом MTS или МТТ 264
4.2.2. Определение способности веществ влиять на пролиферацию клеток (метод с использованием трипанового синего) 265
4.2.3. Определение канцер-превентивной активности веществ 266
4.2.4. Определение способности веществ ингибировать колонеобразование опухолевых клеток в мягком агаре 266
4.2.5. Определение способности веществ ингибировать формирование и рост колоний опухолевых клеток на твёрдой подложке 267
4.2.6. Люциферазный метод определения AP-1-, NFKB- и р53-зависимой транскрипционной активности 267
4.2.7. Приготовление белковых экстрактов для Вестерн-блоттинга, 2D-Вестерн-блоттинга и 2D-PAGE 268
4.2.8. Определение концентрации белка (метод Бредфорда) 269
4.2.9. Вестерн-блоттинг
4.2.10. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2D-PAGE) 271
4.2.11. Анализ рисунков 2Б-гелей 272
4.2.12. Идентификация белков методом масс-спектрометрии 272
4.2.13. Двумерный Вестерн-блоттинг (2Б-Вестерн-блоттинг) 273
4.2.14. Анализ экспрессии простатического специфического антигена (PSA) 274
4.2.15. Исследование синергетического, аддитивного или антагонистического эффекта веществ при их комбинировании 274
4.2.16. Исследование антагонистического эффекта SP600125 (ингибитора JNK1/2) 275
4.2.17. Окрашивание одномерных SDS-полиакриламидных гелей красителем кумасси бриллиантовым синим G 250 275
4.2.18. Исследование белков, содержащихся в образцах 1 и 2, методом масс-спектрометрии (см. 3.3.1.3.) 276
4.2.19. Определение активированной каспазы-3 с помощью FACS 276
4.2.20. Окрашивание лизосом красителем акридиновым оранжевым 277
4.2.21. Измерение выхода катепсина В в межклеточное пространство 277 4.2.22. Клеточное фракционирование 278
4.2.23. Метод полимеразно-цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 2 4.2.23.1. Выделение РНК 279
4.2.23.2. Обратная транскрипция (приготовление кДНК) 280
4.2.23.3. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) 2 4.2.24. Электрофорез ДНК в агарозном геле 280
4.2.25. Полимеразно-цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) 281
4.2.26. Метод проточной цитометрии для исследования способности веществ индуцировать апоптоз 282
4.2.27. Метод проточной цитометрии для исследования влияния веществ на клеточный цикл 282
4.2.28. Исследование эффекта вещества на клеточную миграцию 283
4.2.29. Эксперимент по включению 3H-спермидина 283
4.2.30. Исследование влияния вещества на активность фермента DHS in vitro 2 4.2.30.1. Выделение фермента DHS и белка eIF5A 284
4.2.30.2. Измерение уровня активности фермента DHS in vitro
4.2.31. Сверхэкспрессия деоксигипузинсинтазы (DHS) 285
4.2.32. Биоинформатический анализ протеомных данных 286
4.2.33. Подавление экспрессии гена p53 посредством трансфекции с использованием малых интерферирующих РНК (siRNA) 287
4.2.34. Световая микроскопия 288
4.2.35. Иммуноцитохимический метод и флуоресцентная микроскопия 288
4.2.36. Электронная микроскопия 289
4.2.37. Модели подкожных мышиных ксенографтов 289
4.2.38. Оценка роста опухолей и формирования метастазов 290
4.2.39. Квантификация диссеминированных опухолевых клеток, а также циркулирующих опухолевых клеток при помощи Alu-ПЦР 290
4.2.40. Анализ крови животных 291
4.2.41. Статистическая обработка полученных результатов 2 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 293
6. Выводы 296
7. Список литературы
