Введение
I Введение 8
II Обзор литературы 12
III Материалы и методы 61
1. Выделение антигенов 62
1.1. Выделение липопротеидов 62
1.1.1. Выделение ЛНП из плазмы крови человека.
1.1.1.1. Ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли бромида натрия .
1.1.1.2. Зональное ультрацентрифугирование.
1.1.1.3. Аффинная хроматография.
1.1.2. Выделение Лп(а).
1.1.2.1. Трехступенчатое ультрацентифугирование в ступенчатом градиенте плотности с последующей гель-фильтрацией .
1.1.2.2. Аффинная хроматография.
1.1.3. Получение ЛВП и делипидированной плазмы.
1.2. Очистка препарата IgG человека 66
2. Получение антител 67
2.1. Получение поликлональных антител 67
2.1.1. Иммунизация животных.
2.1.2. Выделение ПкАт к ЛНП.
2.1.3. Выделение ПкАт к Лп(а).
2.1.3.1. Получение моноспецифической антисыворотки.
2.1.3.2. Очистка антител.
2.1.4. Препаративная очистка ПкАт.
2.2. Получение моноклональных антител (МкАт) 69
2.2.1. Гибридизация и скрининг гибридомных клеток.
2.2.2. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости.
2.2.3. Выделение МкАтиз культуральной жидкости.
2.2.4. Препаративная очистка МкАт.
3. Синтез аффинных сорбентов 71
3.1. Активация матриц 71
3.1.1. Активация бромцианом.
3.1.2. Периодатное окисление.
3.2. Иммобилизация белков 72
3.2.1. Иммобилизация липопротеидов
3.2.2. Иммобилизация антител.
3.3. Синтез сорбентов для процедур терапевтического афереза. 73
4. Определение сорбционной емкости иммуносорбентов 73
4.1. Метод колоночной хроматографии 73
4.2. «Batch» метод 74
5. Анализ чистоты и специфичности белков 74
5.1. Электрофоретические методы 74
5.1.1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
5.1.2. Электрофорез в геле агарозы.
5.2. Иммунологические методы 76
5.2.1. Метод двойной радиальной иммунодиффузии.
5.2.2. Иммуноэлектрофорез.
5.2.3. Иммуноблотинг.
5.3. Аналитическое ультрацентрифугирование 77
6. Методы определения концентрации белков липидов 77
6.1. Иммуноферментные методы 77
6.1.1. Синтез конъюгатов антител с пероксидазой.
6.1.2. Определение концентрации антител к ЛНП.
6.1.3. Определение концентрации антител к Лп(а).
6.1.4. Определение концентрации антител к IgG.
6.1.5. Определение концентрации Лп(а) в плазме (сыворотке) крови человека.
6.1.6. Определение титра антител к иммуноглобулинам барана или мыши в плазме крови человека.
6.2. Определение концентрации Лп(а) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини 80
6.3. Определение концентрации апоВ в плазме крови 81
6.4. Определение концентрации иммуноглобулинов G в плазме крови человека 81
6.5. Определение концентрации суммарного белка 81
6.6. Определение концентрации холестерина 82
6.7. Определение концентрации холестерина в клетках 82
7. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели 82
7.1. Получение образцов органных и клеточных культуры аорты человека 82
7.2. Культивирование короткоживущей органной и клеточной культур из аорты человека 83
7.3. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели 83
8. Микроскопическое исследование матриц 83
9. Контроль качества при производстве колонок для клинического применения 83
9.1. Определение стерильности 83
9.2. Испытание на пирогенность 84
9.2.1. Испытание на пирогенность на кроликах.
9.2.2. Испытание на пирогенность с использованием ЛАЛ теста.
9.3. Контроль частиц сефарозы в смывах с колонок 86
9.4. Определение свободного белка в смывах с сорбента 87
10. Проведение процедуры афереза с использованием иммуносорбционных колонок 88
Иммуносорбенты для ЛНП афереза 90
Выделение и характеристика антигена - ЛНП плазмы крови человека 91
VI Выводы 242
VII Список литературы 246
VIII Приложения 280
