Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Цитохром Р450 - ключевой фермент микросомальной монооксигеназной системы ... 12
1.1.1 Способность цитохромов Р450 к индукции 15
1.2 Цитохромы Р450 подсемейства 2В 18
1.3 Индукция генов CYP2B под действием фенобарбитала 20
1.3.1 Механизм активации генов CYP2B под действием фенобарбитала 21
1.3.2 Характеристика дистального промотора генов CYP2B 22
1.3.3 CAR и другие белки, взаимодействующие с элементами дистального промотора генов СУР2В 24
1.3.4 CAR рецептор-опосредованная сигнальная трансдукция и индукция генов CYP2B 28
1.3.5 Участие коактиваторов в CAR-опосредованной активации экспрессии генов CYP2B 30
1.3.6 Характеристика проксимального промотора генов CYP2B 30
1.3.7 Белок, взаимодействующий с проксимальным промотором генов CYP102 и CYP106 Bacillus megaterium 31
1.3.8 Белки, взаимодействующие с проксимальным промотором генов CYP2B млекопитающих 32
1.3.9 Вклад проксимального и дистального промоторов в общий механизм индукции генов CYP2B 34
1.3.10 Другие регуляторные элементы генов CYP2B 35
1.4 Индукция активности CYP2B под действием индукторов ФБ-типа 38
Заключение 40
ГЛАВА 2. Материал и методы 41
2.1 Материалы 41
2.2 Методы 42
2.2.1 Животные 42
2.2.2 Выделение микросом печени животных 43
2.2.3 Определение концентрации белка в микросомах 44
2.2.4 Определение общего содержания цитохрома Р450 в микросомах печени 44
2.2.5 Определение каталитической активности CYP2B 45
2.2.6 Определение каталитической активности CYP3А 45
2.2.7 Метаболизм тестостерона 46
2.2.8 Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях 46
2.2.9 Полусухой электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану 47
2.2.10 Иммунохимический анализ белков микросом 47
2.2.11 Выделение суммарной клеточнойРНК 48
2.2.12 Электрофорез РНК в частично денатурирующих условиях 48
2.2.13 Определение концентрации РНК в образце 48
2.2.14 Реакция обратной транскрипции 49
2.2.15 Мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР) 49
2.2.16 Анализ продуктов ПЦР 51
2.2.17 Выделение ядер из печени крыс 51
2.2.18 Выделение белковых экстрактов ядер 51
2.2.19 Определение количества белка в белковых экстрактах ядер 52
2.2.20 Включение метки в 5-концы ДНК с помощью полинуклеотидкиназы бактериофага Т4 52
2.2.21 Метод задержки ДНК-белковых комплексов в геле 53
2.2.22 Статистическая обработка данных 53
ГЛАВА 3. Результаты 54
3.1 Межвидовые особенности индукции активности CYP2B 54
3.1.1 Межвидовые различия в индукции микросомальной монооксигеназной системы в печени крыс и кроликов под действием 2,4,6- трифенилдиоксана-1,3 54
3.1.2 Экспрессия генов CYP2B в печени крыс и мышей под действием индукторов фенобарбиталового типа 57
3.1.3 Исследование влияния индукторов на образование комплексов ядерных белков с регуляторным элементом NR1 PBREM 59
3.2 Исследование роли последовательности Барби-бокс в индукции экспрессии генов CYP2B 61
3.2.1 Динамика образования ДНК-белковых комплексов с последовательностью Барби- бокс в печени крыс при индукции 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3 и фенобарбиталом 61
3.2.2 Экспрессия генов CYP2B в печени крыс в зависимости от времени действия 2,4,6-
трифенилдиоксана-1,3 и фенобарбитала 64
3.3 Влияние ингибиторов Ser/Thr протеинкиназ и протеинфосфатаз на индукцию активности CYP2B 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3 и фенобарбиталом в печени крыс 66
3.3.1 Ферментативная активность CYP2B в печени крыс 66
3.3.2 Иммуноблот-анализ микросомальных белков CYP2B 68
3.3.3 Анализ экспрессии генов CYP2B в печени крыс при совместном введении ингибиторов и индукторов 70
3.3.4 Анализ экспрессии гена рецептора CAR в печени крыс при совместном введении ингибиторов и индукторов 73
3.3.5 Исследование образования комплексов ядерных белков с регуляторным элементом NR1 генов CYP2B 74
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 76
Заключение 89
Выводы 90
Список цитируемой литературы 91
