Введение
Глава 1. Общая характеристика аэробных метилотрофных бактерий 8
1.1. Особенности метаболизма метилотрофных бактерий 9
1.2. Центральный метаболизм 15
Глава 2. Галофильные микроорганизмы 17
2.1. Осмоадаптация 18
2.2. Гиперосмотический шок 21
2.3. Спектр совместимых растворимых веществ 23
2.3.1. Органические анионные осмолиты 24
2.3.2. Незаряженные осмолиты 28
2.3.3. Цвиттерионные осмолиты 32
2.4. Системы транспорта осмолитов 38
2.5. Пути биосинтеза осмолитов 40
2.5.1. Биосинтез эктоина и гидроксиэктоина 41
2.5.2. Гены биосинтеза эктоина 44
2.6. Галофильные метанотрофы и метилобактерии 46
Глава 3. Материалы и методы исследования 48
3.1. Культивирование бактерий 48
3.2. Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка 50
3.3. Определение активности ферментов 50
3.4. Выделение и анализ осмопротекторов 52
3.5. Молекулярно-биологические методы 52
3.5.1. Выделение геномной ДНК 52
3.5.2. Выделение РНК и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 53
3.5.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 54
3.5.4. Очистка фрагментов ДНК 55
3.5.5. Лигирование фрагментов ДНК 55
3.5.6. Получение компетентных клеток и их трансформация 56
3.5.7. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов 56
3.5.8. Создание праймеров и полимеразные цепные реакции 57
3.5.9. Конъюгация 58
3.6. Определение и анализ нуклеотидов 59
3.7. Клонирование и экспрессия генов 59
3.8. Выделение и очистка белков 60
3.9. Определение физико-химических свойств ферментов 61
Глава 4. Идентификация и характеристика генов биосинтеза эктоина у метилотрофных бактерий 66
4.1. Накопление эктоина гало- и галоалкалофильными метанотрофами 66
4.2. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z 68
4.3. Экспрессия ectABC генов из Mm. alcaliphilum 20Z в Е. coli 75
4.4. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у Methylomicrobium keniense AMOl 77
4.5. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у Methylophaga alcalica М8 80
4.6. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у
Methylophaga thalassica МТ 83
4.7. Сравнительный анализ генов биосинтеза эктоина у метилотрофных бактерий 85
Глава 5. Клонирование и экспрессия генов биосинтеза эктоина из Methylomicrobium alcaliphilum 20Z 99
5.1. Клонирование и очистка рекомбинантной ДАБ-аминотрансферазы 99
5.2. Клонирование и очистка рекомбинантной эктоинсинтазы 100
5.3. Клонирование, очистка и первичная характеристика рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы 101
5.4. Клонирование и очистка рекомбинантной аспартаткиназы 106
Заключение 108
Выводы 110
Список литературы 111
