Введение
1 Обзор литературы 15
1.1 Генетическая изменчивость 15
1.1.1 Классификация мутаций. Мутации и генетический полиморфизм 15
1.1.2 Основные методы выявления мутаций 16
1.1.3. Идентификация новых мутаций 18
1.1.4 Идентификация известных мутаций 20
1.2 Биологические микрочипы как метод анализа генома 21
1.2.1 История создания биологических микрочипов 21
1.2.2 Различные технологические платформы 22
1.2.3 Микрочипы высокой плотности в исследованиях генома человека 24
1.2.4 Диагностические микрочипы низкой плотности 26
1.2.5 Биологические микрочипы на основе трехмерных ячеек геля 27
1.3 Генетические изменения при онкологических заболеваниях 30
1.3.1 Хромосомные аберрации при лейкозах 30
1.3.1.1 Классификация лейкозов 30
1.3.1.2 Хромосомные перестройки в бластных клетках больных лейкозами 32
1.3.1.3 Методы генодиагностики лейкозов 39
1.3.1.3.1 Цитогенетический метод 39
1.3.1.3.2 FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) 40
1.3.1.3.3 Обратная транскрипция с полимеразной цепной реакцией 41
1.3.2 Структурные перестройки генов Т-клеточных рецепторов и определение Т- клональности 42
1.3.2.1 Строение генов Т-клеточных рецепторов 42
1.3.2.2 Основные методы диагностики Т-клеточной клональности 45
1.3.3 Мутации в генах BRCA1/2 и СНЕК2 и наследственные формы РМЖ иРЯ 48
1.3.3.1 Факторы риска развития РМЖ и РЯ 49
1.3.3.2 Наследственные синдромы предрасположенности к РМЖ и РЯ 50
1.3.3.3 Гены предрасположенности к РМЖ и РЯ ...51
1.3.3.3.1 TenhiBRCAl uBRCA2, их структураи функция 52
1.3.3.3.2 Ген СНЕК2, его структураи функция 56
1.3.3.4 Основные типы мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2, ассоциированные с риском развития РМЖ и РЯ 58
1.3.3.4.1 Спектр мутаций генов BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 в различных популяциях 59
1.3.3.4.2 Риск развития рака для носителей BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 мутаций 62
1.3.3.5 Диагностика мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 64
1.4 Генетические маркеры многофакторных заболеваний 65
1.4.1 Гены ферментов системы биотрансформации 66
1.4.1.1 Генетический полиморфизм тиопурин-в-метилтрансферазы (ТРМТ) ...68
1.4.1.1.1 Метаболизм тиопуриновых препаратов в организме человека 68
1. 4.1.1.2 Фермент ТРМТ, его основные свойства и функции в клетке 70
1.4.1.1.3 Полиморфизм гена ТРМТ 71
1.4.1.2 Полиморфизм генов ферментов 1 и 2 фазы биотрансформации 74
1.4.1.2.1 Гены цитохромов Р450 74
1.4.1.2.1.1 ЦитохромР450СУР1А1 75
1.4.1.2.1.2 Подсемейство цитохромов CYPIIC 77
1.4.1.2.1.3 Цитохром Р450 CYP2D6 79
1.4.1.2.2 Гены, кодирующие ферменты фазы 2 биотрансформации 81
1.4.1.2.2.1 Суперсемейство GST 82
1.4.1.2.2.2 Ариламин-М-ацетилтрансферазы (NAT) 84
1.4.1.2.3 Гены системы фолатного метаболизма 86
1.4.1.2.3.1 Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) 87
1.4.1.2.3.2 Метионинсинтазаредуктаза (MTRR) 89
1. 4.1.2.4 Гены системы биотрансформации и онкологические заболевания 91
1.4.2 Генетическая предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям 93
1.4.2.1 Генетические факторы риска развития сердечно-сосудистых заболеваний...93
1.4.2.1.1 Артериальная гипертензия 93
1.4.2.1.2 Ренин-ангиотензиновая и кинин-брадикининовая системы 94
1.4.2.2.1 Характеристика генов 96
1.5 Генетический полиморфизм как основа идентификации личности на молекулярном уровне 99
1.5.1 Молекулярно-генетический анализ в судебно-медицинской экспертизе 99
1.5.2 SNP как мишень для идентификации личности 100
1.5.2Л Локус HLA-DQAI 101
1.5.2.2 Локус ABO 103
1.5.2.3 Локус AMELXY 104
2 Материалы и методы 105
2.1 Клинический материал 105
2.2 Анализ последовательностей, дизайн и синтез праймеров и зондов ..108
2.3 Технология производства биочипов 117
2.4 Выделение РНК 118
2.5 Выделение ДНК 118
2.6 Цитогенетическое исследование 119
2.7 Обратная транскрипция 120
2.8 Полимеразная цепная реакция (ПНР) 121
2.10 Флуоресцентное мечение ПЦР-продукта 131
2.9 Гибридизация на биочипе 132
2.10 Анализ изображения 132
2.11 Другие методы определения мутаций 133
2.12 Статистические методы 133
3 Результаты и обсуждение 136
3.1 Анализ генетических изменений при онкологических заболеваниях с использованием биочипов 136
3.1.1 Выявление и идентификация хромосомных транслокаций 136
3.1.1.1 Выбор транслокаций для анализа на биочипе 136
3.1.1.2 Выбор последовательностей праймеров и зондов 137
3.1.1.3 Разработка процедуры анализа транслокаций 140
3.1.1.4 Скрининг клинических образцов 142
3.1.1.5 Новое место перестройки t(l 1; 19) MLL/ELL 145
3.1.1.6 Сравнение с цитогенетическим методом 146
3.1.1.7 Клиническое значение транслокаций 148
3.1.1.8 Развитие подходов к анализу хромосомных транслокаций 150
3.1.2 Определение Т-клеточной клональности 152
3.1.2.1 Разработка биочипа для анализа перестроенных генов гамма-локуса Т-клеточного рецептора 153
3.1.2.2 Разработка процедуры анализа 154
3.1.2.3 Определение аналитической чувствительности метода 156
3.1.2.4 Апробация метода определения Т-клональности с использованием биочипа 156
3.1.3 Анализ мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственной формой РМЖ и РЯ 162
3.1.3.1 Разработка биочипа и процедуры генотипирования для анализа мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 163
3.1.3.2. Анализ частоты мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 в группах больных РМЖ,РЯиПМЗН 165
3.1.3.3 Клиническое значение мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 169
3.2 Анализ многофакторных заболеваний и фармакогенетические исследования с использованием биочипов.. 172
3.2.1 Анализ полиморфизма генов системы биотрансформации 172
3.2.1.1 Анализ полиморфизма гена ТРМТ. 172
3.2.1.2 Анализ полиморфизма других генов системы биотрансформации 176
3.2.1.2.1 Создание биочипа для анализа полиморфизма генов 1 и 2 фазы биотрансформации 176
3.2.1.2.2 Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития
лейкозов и лимфом у жителей европейской части России 182
3.2.1.2.2.1 Распределение генотипов у взрослых пациентов с НХЛ, В-ХЛЛ
и здоровых доноров 182
3.2.1.2.2.2 Распределение генотипов у детей, больных лейкозом, и здоровых доноров 188
3.2.1.2.3 Распределение генотипов генов системы биотрансформации у здоровых жителей европейской части России 200
3.2.1.2.4 Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития рецидива острого лейкоза у детей 203
3.2.1.2.4.1 Распределение генотипов у первичных больных и у больных в рецидиве заболевания 203
3.2.1.2.4.2 Роль полиморфизма генов системы биотрансформации в развитии рецидива при лейкозах 207
3.2.1.3 Анализ полиморфизма гена NAT2 210
3.2.2 Анализ полиморфизма генов ренин-ангнотензиновой системы 214
3.2.2.1 Разработка биочипа для анализа полиморфизма геновренин-ангиотензиновой системы 214
3.3 Генетическая идентификация личности на основе анализа полиморфных локусов HLADQA1, АВО И AMEL 218
3.3.1 Разработка биочипа для анализа локусов HLADQA1, АВО И AMEL 219
3.3.2 Генотипирование с использованием ИЛ-биочипа 222
3.3.3 Возможность применения ИЛ-биочипа в идентификационных исследованиях 223
3.4 Сравнение метода гибридизации на гидрогелевых биочипах с другими методами анализа мутаций 226
Заключение 228
Выводы 231
Список литературы 233
