Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Системы рестрикции-модификации у прокариот 9
1. 1. 1. Сайт-специфические эндонуклеазы и ДНК-метилтрансферазы 9
1. 1.2. Классификация ферментов систем рестрикции-модификации 9
1. 1.3. Системы рестрикции-модификации типа І Ю
1. 1.4. Системы рестрикции-модификации типа II 1О
1. 1.5. Системы рестрикции-модификации типа III 12
1. 1.6. Молекулярная организация систем рестрикции-модификации 13
1. 1.7. Распространение систем рестрикции-модификации 14
1. 2. Метилирование ДНК в E.coli и ее роль в регуляции генной экспрессии 16
1.3. Регуляция экспрессии генов в системах рестрикции-модификации 18
1.3. 1. Регуляция экспрессии генов системы рестрикции-модификации Llal из Lactococcus lactus 19
1.3.2. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа I и III 20
1.3.3. Регуляция экспрессии генов в системах рестрикции-модификации типа II 21 1. 4. Общая характеристика структурных и функциональных свойств ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. Coli 30
1. 5. Особенности нуклеотидной последовательности промотора и инициация транскрипции 31
1. 6. Транскрипционная интерференция 36
1.6. 1. Механизмы транскрипционной интерференции Зо
1.6. 1. 1. Конкуренция промоторов Зо
1.6. 1.2. Механизм "сидячей утки" Зо
1. 6. 1. 3. Окклюзия 4"
1.6. 1.4. Столкновение 1
Глава 2. Материалы и методы исследований 43
2. 1. Материалы 43
2. 1. 1. Штаммы бактерий и плазмидные вектора 43
2. 1.2. Среды и основные буферы 43
2. 1.3. Материалы и реактивы 44
2. 2. Методы исследования 45
2. 2. 1. Получение бактериальной биомассы 45
2. 2. 2. Выделение плазмидной ДНК 45
2. 2. 2. 1. Лизис щелочью 45
2. 2. 2. 2. Очистка ДНК в градиенте хлористого цезия 46
2. 2. 3. Выделение тотальной РНК 47
2. 2. 4. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация 47
2. 2. 5. Анализ рекомбинантных клонов 48
2. 2. 6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 48
2. 2. 7. Препаративное выделение фрагментов ДНК 49
2. 2. 8. Плазмидные конструкции 49
2.2. 9. Мечение 5-концаДНК полинуклеотидкиназой фагаТ4 50
2. 2. 10. Реакция транскрипции in vitro 50
2. 2. 11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 51
2. 2. 12. Лигирование фрагментов ДНК 51
2. 2. 13. Реакция метилирования in vitro 51
2. 2. 14. Образование комплекса M.Ecll8kl с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации Eel 18kl 52
2. 2. 15. Защита ДНК от расщепления ДНКазой I 52
54
2. 2. 16. КМп04 (перманганатный) футпринтинг 53
2.2. 17. Реакция удлинения праймера 2. 2. 18. Определение уровня транскрипции с промоторов генов системы
рестрикции-модификации Ес118кТ
2. 2. 19. Экспрессия и очистка метилтрансферазы M.Ecll8kI-N6His
до гомогенного состояния 55
2. 2. 20. Очистка РНК-полимеразы 56
2.2.21. Электрофорез ДНК и белков 56
Глава 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Структурная организация системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl 57
3. 2. Определение сайта связывания M.Ecl 18kl 60
3. 3. Генетическая организация регуляторной области системы рестрикции-модификации Eel 18kl 61
3. 4. Регуляция транскрипции с промоторов генов ec!18kI.R и ecll8kI.M,
осуществляемая метилтрансферазой M.Ecl 18kl in vitro 63
3. 5. Определение уровня транскрипции с промоторов генов системы
рестрикции-модификации Eel 18kl 71
3. 6. Модель регуляции транскрипции генов системы рестрикции-модификации Ecll 8kl 74
Выводы 76
Список литературы
