Введение
Обзор литературы 9
1. Открытие вируса иммунодефицита человека первого типа 9
2. Строение вириона ВИЧ-1 9
3. Организация генома ВИЧ-1 11
3.1. Структура и функции LTR провирусной ДНК ВИЧ-1 11
3.1.1. Структура и функции иЗ-региона 5-LTR провирусной ДНК 12
3.1.2. Структура и функции R-региона 5-LTR провирусной ДНК 15
3.1.3. Структура и функции Ш-региона 5-LTR провирусной ДНК 17
3.2. Структура области вирусной РНК, предшествующей gag-стартовому кодону 17
3.2.1. Вторичная структура и функции шпильки DIS (SL1) РНК ВИЧ-1 20
3.2.2. Вторичная структура и функции шпильки SD (SL2) РНК ВИЧ-1 22
3.2.3. Вторичная структура и функции шпильки у (SL3) РНК ВИЧ-1 24
3.2.4. Шпилька SL4 25
3.2.5. Ш-АШ-дуплекс 25
3.2.6. Структура областей между шпильками 26
3.2.7. Пространственная структура и упаковка геномной РНК ВИЧ-1 26
3.3. Структурные гены ВИЧ-1 29
3.3.1. Ген gag 29
3.3.2. Ген рої 29
3.3.3. Tenenv ЗО
3.4. Гены и основные функции регуляторных и вспомогательных белков 31
3.4.1. Строение Vpr 34
3.4.2. Положение и синтез Vpr 35
3.4.3. Функции Vpr 36
3.4.3.1. Влияние на точность обратной транскрипции 37
3.4.3.2. Vpr и импорт в ядро преинтеграционного комплекса 38
3.4.3.3. Vpr и клеточный цикл 40
3.4.3.4. Разрушение двунитевой ДНК 41
3.4.3.5. VprnanonT03 42
3.4.3.6. Роль Vpr в усилении LTR-направленной транскрипции 44
4. Этапы ВИЧ-инфекции 45
4.1. Ранняя и текущая инфекция 46
4.1. Дифференциальная диагностика ранней и текущей инфекции 46
5. Анализ полиморфизма ВИЧ-1 как инструмент эпидемиологического мониторинга 47
5.1. Деление вируса на подтипы 47
5.3. Природа изменчивости ВИЧ-1 48
5.2. Полиморфизм вируса 49
6. Молекулярный мониторинг ВИЧ-инфекции в России 49
6.1. Эпидемия ВИЧ-инфекции в России 49
6.2. Подтипы ВИЧ-1, обнаруживаемые в России 51
7. Генная терапия ВИЧ-инфекции 51
7.1. Терапии, базирующиеся на применении нуклеиновых кислот 52
7.2. Терапия, базирующаяся на белках 54
Экспериментальная часть 57
1. Материалы и методы 57
1.1. Объект исследования 57
1.2. Сбор эпидемиологических данных 58
1.3. Методы дифференциального анализа ранней и текущей инфекции 58
1.3.1. Чувствительный/низкочувствительный иммуноферментный анализ (S/LS ELISA) 58
1.3.2. Иммуноферментный анализ с использованием хаотропного агента 58
1.3.3. ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа gp41 (ИДЭ-р41) 59
1.3.4. Изотип-специфический Western blot 59
1.4. Метод получения «грубых» лизатов мононуклеарных клеток периферической крови 60
1.5. Анализ электрофоретической подвижности молекул в агарозном геле 60
1.6. Применение метода гнездовой ПЦР для получения 61
ампликонов исследуемых областей ДНК 61
1.6.1. Амплификация нуклеотидных последовательностей области 5-LTR 61
1.6.2. Амплификация нуклеотидных последовательностей области, 62
предшествующей gag - стартовому кодону 62
1.6.3. Амплификация области гена vpr 62
1.7. Метод очистки ДНК из геля методом Jetquick 62
1.8. Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК 62
2. Результаты 63
2.1. Сравнительный анализ лабораторных методов дифференциальной диагностики ранней ВИЧ-инфекции 63
2.1.1. Чувствительный/низкочувствительный ИФА 63
2.1.2. ИФА с использованием 8М мочевины 63
2.1.3. ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа gp41 65
2.1.4. Изотип-специфический Western blot 65
2.2. Анализ области 5-LTR провирусной ДНК варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего на территории России 65
2.2.1. Филогенетический анализ области 5-LTR 65
2.2.2. Анализ области U3 68
2.2.3. Анализ области R 71
2.2.4. Анализ области U5 74
2.3. Анализ области вирусной РНК, предшествующей garg-стартовому кодону варианта IDU-A ВИЧ-1 75
2.4. Анализ области гена vpr варианта IDU-A ВИЧ-1 77
2.4.1. Филогенетический анализ области гена vpr 77
2.4.2. Анализ мутаций в структуре гена vpr 77
Обсуждение 81
Выводы 93
Список литературы
