Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Введение 12
1.2. Ультраструктура и мехаиизм сборки жгутиков и ресничек 13
1.2.1. Ультраструктура жгутиков и первичных ресничек 13
1.2.2. Процесс формирования ресничек в клетке 15
1.2.3. Молекулярные механизмы сборки ресничек 16
1.2.3.1. Открытие внутриреснитчатого транспорта 16
1.2.3.2. Моторные белки осуществляющие ВРТ 16
1.2.3.2. Белковый состав частиц ВРТ 17
1.2.3.4. Современная модель ВРТ 18
1.3. Первичные реснички и жгутики в патологии человека 19
1.3.1. Роль ресничек в эмбриогенезе 19
1.3.2. Сенсорная функция первичных ресничек 21
1.3.3. Роль ресничек в поликистозной болезни почки 21
1.3.3.1. Функции ресничек в почке 21
1.3.3.2. Молекулярный механизм сенсорной функции ресничек в почке 22
1.3.4. Роль первичных ресничек в эмбриональном развитии 23
1.4. Синдром Барде-Бидля 24
1.4.1. Описание синдрома Барде-Бидля 24
1.4.2. Мутации предопределяющие BBS ." 26
1.4.3. Механизм наследования синдрома Барде-Бидля 29
1.4.4. Связь BBS белков в первичными ресничками 30
1.4.5. Генетические модели синдрома Барде-Бидля у мышей 31
1.4.6. Функции BBS белков у рыб Danio rerio 33
1.4.7. Молекулярные механизмы BBS 34
1.4.7.1. Особенности первичной структуры BBS белков 34
1.4.7.2. Модель функции BBS белков у C.elegans 35
1.4.7.3. Роль BBS4 в транспорте центриольных спутников 36
1.4.7.4. Роль BBS белков в поляризации эпителия 37
1.4.7.5. Структурные особенности BBS6, BBS10 и BBS12 38
1.5. Заключение 39
Глава 2. Материалы и Методы 41
2.1. Материалы 41
2.1.1. Реактивы 41
2.1.2. Плазмиды 41
2.1.3. Малые интерферирующие РНК 41
2.1.4. Антитела 42
2.2. Основные методы 43
2.2.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 43
2.2.2. Электрофорез 44
2.2.3. Количественный иммуноблот (КИБ) 44
2.2.4. Клеточные культуры 44
2.2.5. Тандемная аффинная очистка белков 45
2.2.6. Фракционирование ББсомы в градиенте плотности сахарозы 45
2.2.7. Фракционирование клеточных мембран в градиенте плотности сахарозы 45
2.2.8. Гель-фильтрация лизатов семенников мыши и RPE клеток 46
2.2.8. Трансфекция 46
2.2.9. Количественная ОТ-ПЦР (кОТ-ПЦР) 46
2.2.10. Иммунопреципитация (ИП) 46
2.2.11. Иммунофлюоресцентная микроскопия (ИФМ) 47
2.2.12. Видеомикроскопия 47
2.2.13. Эксперименты с микротрубочками in vitro 48
2.2.14. Анализ вторичной и третичной структуры BBS5 48
2.2.15. Анализ пузырьков Купфера и транспорта меланосом у D.rerio 48
Глава 3. Результаты и обсуждение 49
3.1. Выделение и изучение функции комплекса BBS белков 49
3.1.1. Выделение и биохимическая характеризация комплекса BBS белков 49
3.1.1.1. Получение клеточной линии RPE-[JIAO]BBS4 49
3.1.1.2. Очистка и идентификация белков, ассоциированных с BBS4 51
3.1.1.3. Физико-химическая характеризация комплекса белков, ассоциированных с BBS4 53
3.1.2. Роль ББсомы и центриольных спутников в формировании ресничек 58
3.1.2.1. Роль РСМ-1 и ББсомы в формировании ЦС и ресничек 58
3.1.2.2. Связывание ББсомы с мембраной первичной реснички 60
3.1.2.3. Роль BBS5 в связывании ББсомы с мембраной реснички 62
3.1.3. Роль ГТФазы Rab8 в формировании ресничек 64
3.1.3.1. Изучение связывания ББсомы с белком Rabin8 64
3.1.3.2. Роль Rab8 в образовании мембран ресничек 66
3.2. Идентификация и исследование функций нового белка ВВІРЮ 70
3.2.1. Идентификация и характеризация нового белка в составе ББсомы 70
3.2.1.1. Обнаружение неизвестного белка в составе ББсомы 70
3.2.1.2. Характеризация взаимодействия ВВІРЮ с ББсомой 73
3.2.2. Роль ВВІРЮ в образовании и функции ресничек 74
3.2.2.1. Роль ВВІРЮ в образовании ресничек в RPE клетках 74
3.2.2.2. Изучение роли ВВІРЮ в функции ресничек у D.rerio 77
3.2.2.3. Корелляция экспрессии ВВІРЮ с BBS белками 77
3.2.3. Сравнительный анализ функций ВВІРЮ и BBS белков 78
3.2.4. Изучение роли ВВІРЮ в регуляции стабильности и ацетилировапия микротрубочек.. 84
3.2.4.1. Пост-трансляционные модификации тубулина 84
3.2.4.2. Исследование эффекта ингибирования ВВІРЮ на пост-трансляционные модификации тубулина 85
3.2.4.3. Исследование повышенной экспрессии ВВІРЮ 88
3.2.5. Изучение механизма регуляции ацетилирования МТ при помощи ВВІРЮ 91
3.2.5.1. Роль ВВІРЮ в динамике полимеризации МТ в клетках 91
3.2.5.2. Исследование взаимоотношения между формированием и ацетилированием МТ 92
3.2.5.3. Исследование взаимодействия между ВВІРЮ и HDAC6 94 ,
3.3. Заключение 97
Выводы 101
Список используемой литературы
