Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 11
Раздел 1.1 Таргетная терапия 11
1.1.1 Ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста в противоопухолевой терапии 11
1.1.2 Ингибиторы других участников EGFR-зависимого сигнального каскада... 13
Раздел 1.2 Структурно-функциональная характеристика участников EGFR зависимого сигнального каскада 14
1.2.1 Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) 14
1.2.1.1 Структурно-функциональная характеристика гена EGFR 14
1.2.1.2 Структурно-функциональная характеристика белка EGFR 15
1.2.1.3 Клинически значимые мутации в reneEGFR 20
1.2.2 Малая сигнальная ГТФ-аза (KRAS) 23
1.2.2.1 Структурно-функциональная характеристика гепа, KRAS 23
1.2.2.2 Структурно-функциональная характеристика белка KRAS 24
1.2.2.3 Клинически значимые мутации в геие KRAS 27
1.2.3 Фосфоинозитид-3-киназа, каталитическая субъединица (PIK3CA) 29
1.2.3.1 Структурно-функциональная характеристика гена PIK3CA 29
1.2.3.2 Структурно-функциональная характеристика белка PIK3CA 30
1.2.3.3 Клинически значимые мутации в гене PIK3CA 32
1.2.4 Серин/треонин протеинкиназа (BRAF) 34
1.2 А А Структурно-функциональная характеристика гена BRAF 34
1.2.4.2 Структурно-функциональная характеристика белка BRAF 35
1.2.4.3 Клинически значимые мутации в reneBRAF 37
1.2.5 Распространенность мутаций в генах EGFR, KRAF, PIK3CA и BRAF в опухолях человека различной локализации 40
Раздел 1.3 Молекулярно-генетические методы диагностики соматических мутаций... 41
Раздел 1.4 Биологические микрочипы и их применение 47
ГЛАВА 2 Материалы и методы 51
2.1 Клинический материал 52
2.2 Экстракция ДНК 2.2.1 Экстракция ДНК из ткани, фиксированной в парафиновых блоках 55
2.2.2 Экстракция ДНК из свежезамороженной ткани 55
2.3 Конструирование и синтез олигонуклеотидов 55
2.3.1 Конструирование и синтез праймеров 55
2.3.2 Конструирование и синтез LNA-олигонуклеотидов 55
2.3.3 Конструирование и синтез зондов для иммобилизации на биочипах 56 2.4 Изготовление биологических микрочипов 56
2.5 Сайт-направленный мутагенез
2.5.1 Двухэтапный сайт-направленный мутагенез 57
2.5.2 Одноэтапный сайт-направленный мутагенез
2.6 Полимеразная цепная реакция (ПОР) 58
2.7 Гибридизация меченого продукта на биочипе 58
2.8 Регистрация изображения и анализ результатов гибридизации 59
2.9 Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в агарозном геле 60
2.10 Секвенирование 60
2.11 Статистический анализ 60
2.12 Другие методы определения мутаций
2.12.1 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ)... 61
2.12.2 Секвенирование с предварительным обогащением образца мутантной ДНК 61
2.12.3 Аллель-специфичная ПЦР в реальном времени 61
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение 62
Раздел 3.1 Разработка метода анализа соматических мутаций на основе биологических микрочипов 62
3.1.1 Конструирование системы амплификации для анализа целевых последовательностей генов 64
3.1.1.1 Разработка системы праймеров для проведения двухэтапной мультиплексной ПЦР 64
3.1.1.2 Конструирование LNA-олигонуклеотидов и выбор их оптимальной концентрации в ПЦР-смеси 65
3.1.1.3 Создание контрольных ДНК-матриц, содержащих мутации в генах EGFR, KRAS, BRAF и PIK3CA 68
3.1.2 Разработка олигонуклеотидных микрочипов 70
3.1.2.1 Конструирование олигонуклеотидных зондов для иммобилизации на микрочипах 70
3.1.2.2 Конструирование специализированных биочипов
3.1.2.2.1 Анализ мутаций в reneEGFR 73
3.1.2.2.2 Анализ мутаций в геие KRAS 75
3.1.2.2.3 Анализ мутаций в генах.PIK3CA nBRAF 77
ЗА.2.2 А Биочип для анализа мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF 78
3.1.3 Определение аналитической чувствительности метода 80
Раздел 3.2 Генотипирование клинических образцов 81
3.2.1 Генотипирование образцов опухолей поджелудочной железы 81
3.2.1.1 Анализ мутаций в геие KRAS с помощью биочипов 81
3.2.1.2 Выявление ассоциаций между наличием мутаций в гене KRAS и клинико анамнестическими характеристиками пациентов с опухолями ПЖ 82
3.2.1.3 Верификация результатов генотипирования образцов опухолей ПЖ на наличие мутаций в геие KRAS 82
3.2.2 Генотипирование образцов колоректального рака 83
3.2.2.1 Анализ мутаций в генах KRAS, BRAF и PIK3CA с помощью биочипов 83
3.2.2.2 Выявление ассоциаций между молекулярно-генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками больных КРР 84
3.2.2.3 Верификация результатов генотипирования образцов КРР на наличие мутаций в геие KRAS 88
3.2.3 Генотипирование образцов меланомы 89
3.2.3.1 Анализ мутаций в генах.PIK3CA nBRAF 89
3.2.3.2 Выявление ассоциаций между молекулярно-генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками больных меланомой 92
3.2.3.3 Верификация результатов генотипирования образцов меланомы на наличие мутации V600E в гене BRAF 95
3.2.4 Генотипирование образцов НМРЛ 95
3.2.4.1 Анализ мутаций в образцах НМРЛ с помощью биочипов 95
3.2.4.1.1 Анализ свежезамороженных опухолевых биопсий НМРЛ на наличие мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF 97
3.2.4.1.2 Анализ фиксированных в парафиновых блоках образцов НМРЛ на наличие мутаций в генах EGFR и KRAS 3.2.4.2 Выявление ассоциаций между молекулярно-генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками больных НМРЛ.. 98
3.2.4.3 Верификация результатов генотипирования образцов НМРЛ на наличие мутации в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF 102
3.2.5 Различие в спектре мутаций в гене KRAS в опухолях различной локализации 105
Заключение 106
Выводы 107
Список работ, опубликованных по теме диссертации 108
Список литературы
