Введение
Глава 1. Обзор литературы Факторы, обеспечивающие эффективную терминацию трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и их взаимодействие 10
1.1. S. cerevisiae как объект генетики 10
1.2. Общие сведения о процессе трансляции у дрожжей S. cerevisiae
1.2.1. Состав рибосомы и регуляция синтеза компонентов рибосомы 16
1.2.2. Инициация трансляции 21
1.2.3. Элонгация трансляции 23
1.2.4. Терминация трансляции и рециклирование рибосом 25
1.2.5. Деградация РНК с преждевременным стоп-кодоном 26
1.3. Контроль эффективности терминации трансляции 28
1.3.1. Влияние последовательности и стабильности мРНК на вероятность считывания стоп-кодона 28
1.3.2. Роль тРНК в считывании стоп-кодонов 29
1.3.3. Роль рРНК и рибосомных белков в считывании стоп-кодонов 31
1.3.4. Влияние изменений в белках, принимающих участие в терминации трансляции, на эффективность этого процесса 32
1.3.5. Влияние белков, участвующих в других этапах трансляции, на терминацию трансляции 34
1.3.6. Другие факторы, влияющие на считывание стоп-кодонов 34
1.4. Прионы дрожжей 36
1.4.1. Разнообразие и общие свойства прионов дрожжей 36
1.4.2. Связь [PSI+] с терминацией трансляции 41
1.4.3. [NSI+] и терминация трансляции 42
1.4.4. MOD5, [MOD+] и терминация трансляции 42
1.4.5. [ISP+] 43
1.5. Заключение 49
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1. Штаммы 51
2.2. Среды и методы культивирования 53
2.3. Методы генетики дрожжей 55
2.4. Методы микроскопии 55
2.5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами
2.5.1. Выделение ДНК 56
2.5.2. Выделение РНК 57
2.5.3. Плазмиды, конструирование и проверка плазмид 57
2.5.4. ПЦР, обратная транскрипция и гибридизация ДНК 60
2.5.5. Электрофорез нуклеиновых кислот 61
2.5.6. Получение делеций генов с помощью гомологичной рекомбинации 62
2.5.7. Секвенирование ДНК 63
2.6. Методы работы с белками 63
2.6.1. Выделение белков 63
2.6.2. Определение активности кислой фосфатазы 64
2.7. Анализ данных 64
2.7.1. Статистические методы 64
2.7.2. Анализ данных ОТ-ПЦР-РВ 65
2.7.3. Анализ изображений 65
2.7.4. Обработка данных экспрессии генов, полученных при гибридизации с ДНК-микрочипом 66
2.7.5. Работа с последовательностями нуклеиновых кислот 66
Глава 3. Результаты 68
3.1. Общая характеристика особенностей фенотипа и генотипа штамма 25-25-2В-П3982 68
3.1.1. Проверка известных данных об особенностях генотипического фона 25-25-2В-П3982 70
3.1.2. Анализ новых данных об особенностях генотипического фона изучаемого штамма 72
3.2. Влияние сверхпродукции Q/N-богатых регуляторов
транскрипции на изменение фенотипа клонов с Isp– на Isp+ 76
3.2.1. Сверхпродукция Swi1p, но не других аспарагин-глутамин-богатых регуляторов транскрипции, увеличивает частоту появления клонов Isp+ в потомстве клонов Isp– 77
3.2.2. Влияние сверхпродукции Swi1p на частоту появления клонов Isp+ не связано с его агрегацией 79
3.2.3. Влияние сверхэкспрессии SWI1 на частоту появления клонов Isp+ не связано с изменением уровня мРНК SFP1 83
3.2.4. В потомстве трансформантов со сверхэкспрессией SWI1 появляются автодиплоидные клоны 84
3.3. Влияние Isp-статуса штамма и делеции гена SFP1 на экспрессию белок-кодирующих генов дрожжей 87
3.3.1. В клетках Isp+, в отличие от клеток sfp1, не снижена экспрессия мишеней Sfp1p 89
3.3.2. В клетках Isp+ не изменена транскрипция большинства генов биогенеза рибосом и генов рибосомных белков 90
3.3.3. Делеция гена CRF1 не влияет на проявление фенотипа Isp+ 92
3.3.4. Делеция и сверхэкспрессия гена RPS9A не влияют на проявление фенотипа Isp+ 94
3.3.5. Транскрипционные факторы, мишени которых различаются по уровню экспрессии в клонах Isp+ и Isp– 99
3.3.6. Функциональная классификация генов, экспрессия которых изменяется при делеции SFP1 или изменении фенотипа c Isp– на Isp+ 101
3.3.7. В клетках Isp+ активирована транскрипция генов белков клеточной стенки и генов, контролирующих импорт ионов железа 101
3.3.8. В клонах Isp– усилена экспрессия генов хромосом II и IX 103
3.4. Сравнительный анализ геномов клонов Isp+ и Isp– 105 3.4.1. Секвенирование геномов подтверждает данные о вариабельной копийности хромосом II и IX 105
3.4.2. Анализ кариотипа независимо полученных клонов Isp+ и Isp–1
3.5. Поиск связи между геном SFP1 и фенотипом Isp+ 110
3.6. Поиск связи между обработкой GuHCl и изменением кариотипа 112
3.7. Анализ отдельных генов, изменение числа копий которых может объяснять различие фенотипов Isp+ и Isp– 1
3.7.1. Введение дополнительной копии his7-1 улучшает рост клонов Isp+ на среде без гистидина 118
3.7.2. Доза гена sup45-400 не определяет различие фенотипов Isp+ и Isp– 118
3.7.3. Cверхэкспрессия некоторых генов тРНК и гена TEF2 увеличивает эффективность нонсенс-супрессии 122
Глава 4. Обсуждение 124
4.1. Фенотип Isp+ и его связь с уровнем экспрессии различных генов 124
4.2. Связь фенотипа Isp– и кариотипа клона 126
4.3. Идентичность штаммов, использованных различными исследователями в ходе изучения фенотипа Isp+ 131
4.4. Влияние GuHCl на появление клонов Isp– в потомстве клонов Isp+ 132
4.5. Участие гена SFP1 в изменении фенотипа с Isp– на Isp+ 134
4.6. Участие гена SWI1 в переходе от фенотипа Isp– к фенотипу Isp+ 138
4.7. Нестабильность кариотипа исследуемых штаммов 139
4.8. Заключение 141
Глава 5. Выводы 142
Список сокращений и условных обозначений 143
Список литературы
