Введение
1 Обзор литературы 16
2 Материалы и методы
2.1 Гистологическое и иммуногистохимическое исследование строения пупочного канатика 36
2.2 Выделение первичной культуры из пупочного канатика человека ферментативным методом 37
2.3 Выделение первичной культуры из пупочного канатика крысы методом эксплантов 38
2.4 Анализ иммунофенотипа МСК ПК 38
2.5 Направленная дифференцировка МСК ПК 39
2.6 Иммуноцитохимическое исследование экспрессии Ki67, виментина и гладкомышечного актина в культуре МСК ПК 40
2.7 Линия эндотелиальных клеток EA.hy926 40
2.8 Приготовление кондиционированных сред 41
2.9 Измерение концентрации VEGF-A в средах, кондиционированных МСК ПК и EA.hy926 42
2.10 Оценка влияния среды, кондиционированной МСК ПК, на пролиферацию эндотелиальных клеток 42
2.11 Направленная миграция эндотелиальных клеток в градиенте факторов, секретируемых МСК ПК 43
2.12 Оценка влияния кондиционированной МСК ПК среды на подвижность эндотелиальных клеток на модели «рана монослоя» 44
2.13 Эндотелиальная дифференцировка МСК ПК на стандартной подложке 44
2.14 Оценка влияния кондиционированной МСК ПК среды на эндотелиальные
клетки при моделировании ангиогенеза в матриксе базальной мембраны in vitro
2.15 Оценка взаимодействия МСК ПК и эндотелиальных клеток при моделировании ангиогенеза в матриксе базальной мембраны in vitro 46
2.16 Эндотелиальная дифференцировка МСК ПК в матриксе базальной мембраны 46
2.17 Экспериментальные животные 47
2.18 Моделирование ишемии задних конечностей крыс 47
2.19 Подготовка клеточного трансплантата 49
2.20 Трансплантация МСК ПК 49
2.21 Тест толерантности к физическим нагрузкам «рота-род» 50
2.22 Выведение животных из эксперимента 50
2.23 Морфометрическое исследование 51
2.24 Иммуногистохимическое исследование 52
2.25 Колокализационный анализ 53
2.26 Статистический анализ 53
3 Результаты 54
3.1. Получение и характеристика культур мультипотентных стромальных клеток пупочного канатика 54
3.1.1 Строение пупочного канатика человека 54
3.1.2 Строение пупочного канатика крысы 58
3.1.3 Выделение первичной культуры из пупочного канатика человека 59
3.1.4 Выделение первичной культуры из пупочного канатика крысы 60
3.1.5 Анализ иммунофенотипа МСК ПК 61
3.1.6 Направленная дифференцировка МСК ПК 63
3.1.7 Иммуноцитохимическое исследование фенотипа культуры МСК ПК 66
3.2 Исследование ангиогенных свойств МСК ПК in vitro 68
3.2.1 Линия эндотелиальных клеток EA.hy926 68
3.2.2 Измерение концентрации VEGF-A в средах, кондиционированных МСК ПК и EA.hy926 69
3.2.3 Оценка влияния среды, кондиционированной МСК ПК, на пролиферацию эндотелиальных клеток 70
3.2.4 Направленная миграция эндотелиальных клеток в градиенте факторов, секретируемых МСК ПК 71
3.2.5 Оценка влияния кондиционированной МСК ПК среды на подвижность эндотелиальных клеток на модели «рана монослоя» 72
3.2.6 Эндотелиальная дифференцировка МСК ПК на стандартной подложке 74
3.2.7 Оценка влияния кондиционированной МСК ПК среды на эндотелиальные клетки линии EA.hy926 при моделировании ангиогенеза в матриксе базальной мембраны in vitro 77
3.2.8 Оценка взаимодействия МСК ПК и эндотелиальных клеток линии EA.hy926 при моделировании ангиогенеза в матриксе базальной мембраны in vitro 80
3.2.9 Эндотелиальная дифференцировка МСК ПК в матриксе базальной мембраны .86
3.3 Исследование ангиогенных свойств МСК ПК in vivo 89
3.3.1 Моделирование ишемии задних конечностей крыс 89
3.3.2 Транcплантация МСК ПК 89
3.3.3 Тест толерантности к физическим нагрузкам «рота-род» 89
3.3.4 Морфометрическое исследование очага ишемического повреждения скелетной мышечной ткани 90
3.3.5 Оценка влияния трансплантации МСК ПК на макрофагальную инфильтрацию в очаге повреждения ишемизированной ткани 94
3.3.6 Морфометрическое исследование ангиогенеза в очаге ишемического повреждения скелетной мышечной ткани 98
3.3.7 Исследование распределения трансплантированных МСК ПК в ишемизированной ткани 101
3.3.8 Исследование элиминации транспслантированных МСК ПК в ишемизированной ткани 105
3.3.9 Оценка дифференцировки трансплантированных МСК ПК в эндотелиальном направлении 4 Обсуждение 112
5 Заключение 133
6 Выводы 137
7 Список сокращений 139
8 Список литературы 141
