Введение
Глава 1. Обзор литературы 18
1.1. Сократительный аппарат кардиомиоцитов 18
1.1.1. Строение сократительного аппарата кардиомиоцитов 18
1.1.2. Миофибриллогенез 21
1.2. Сократительная система немышечных клеток 23
1.2.1. Цитоскелет 23
1.2.2. Стресс-фибриллы 24
1.3. Актин 25
1.3.1. Структура актина 25
1.3.2. Полимеризация и деполимеризация актина 26
1.3.3. Актин-связывающие белки 28
1.3.4. Изоформы актина 29
1.3.5. Распределение изоформ актина 31
1.3.6. Механизмы, обеспечивающие разные функции изоформ актина 37
1.3.7. Смена изформ актина в ходе дифференцировки кардиомиоцитов из стволовых клеток 38
1.3.8. Смена изформ актина при культивировании кардиомиоцитов 39
1.3.9. Экспрессия гладкомышечного -актина при патологии 39
1.4. Регенерация сердца 40
1.5. Методы дифференцировки кардиомиоцитов 42
1.6. Первичная культура кардиомиоцитов 52
1.7. Внеклеточный матрикс
1.7.1. Внеклечтоный матрикс сердца 53
1.7.2. Матриксные металлопротеиназы 57
1.7.3. Культивирование кардиомиоцитов
в присутствии компонентов внеклеточного матрикса 64
Глава 2. Материалы и методы 69
2.1. Получение первичной культуры кардиомиоцитов 69
2.2. Получение культуры сердечных фибробластов 71
2.3. Культивирование кардиомиоцитов в кондиционированной среде от фибробластов 71
2.4. Культивирование кардиомиоцитов на отдельных белках внеклеточного матрикса 72
2.5. Получение проб внеклеточного матрикса, наработанного кардиомиоцитами или сердечными фибробластами 72
2.6. Культивирование кардиомиоцитов на матриксе, полученном от кардиомиоцитов или сердечных фибробластов 73
2.7. Культивирование кардиомиоцитов в коллагеновых гелях 73
2.8. Флуоресцентное окрашивание структур сократительного аппарата кардиомиоцитов 74
2.9. Выявление внеклеточных коллагеновых структур 75
2.10. Конфокальная микроскопия 76
2.11. Получение клеточных лизатов 76
2.12. Электрофоретический анализ 77
2.13. Вестерн-блоттинг 78
2.14. Идентификация белков методом масс-спектрометрии 79
2.15. Идентификация матриксных металлопротеиназ
методом зимографии 80
2.16. Экстракция РНК, синтез кДНК и ПЦР-реакции 81
2.17. Статистический анализ 82
Глава 3. Результаты 83
3.1. Организация сократительного аппарата кардиомиоцитов на разных сроках культивирования 83
3.2. Влияние отдельных белков внеклеточного матрикса на перестройки сократительного аппарата кардиомиоцитов в культуре 88
3.3. Синтез внеклеточного матрикса кардиомиоцитами в культуре 92
3.4. Продукция ламинина и коллагена кардиомиоцитами в культуре 93
3.5. Выявление коллагеновых структур во внеклеточном матриксе кардиомиоцитов 96
3.6. Матриксные металлопротеиназы на разных сроках культивирования кардиомиоцитов 97
3.7. Организация сократительного аппарата кардиомиоцитов при их культивировании на матриксе от таких же кардиомиоцитов 100
3.8. Сравнение внеклеточного матрикса, наработанного кардиомиоцитами, и матрикса, наработанного сердечными фибробластами 102
3.9. Организация сократительного аппарата кардиомиоцитов при их культивировании на матриксе, наработанном сердечными фибробластами 104
3.10. Организация сократительного аппарата кардиомиоцитов при их культивировании в кондиционированной среде от сердечных фибробластов 106
3.11. Организация сократительного аппарата кардиомиоцитов при их культивировании в гелях с разной концентрацией коллагена 108
3.12. Организация сократительного аппарата кардиомиоцитов на разных сроках культивирования
в коллагеновых гелях с концентрацией 1 мг/мл 110
3.13. Матриксные металлопротеиназы на разных сроках культивирования кардиомиоцитов в коллагеновых гелях с концентрацией коллагена 1 мг/мл 112
3.14. Экспрессия изоформ актина в кардиомиоцитах в процессе культивирования 114
3.15. Синтез -гладкомышечного актина в кардиомиоцитах в процессе культивирования 115
3.16. Обратная корреляция между синтезом внеклеточного матрикса и гладкомышечного -актина в кардиомиоцитах 117
3.17. Локализация гладкомышечного -актина в сократительных структурах кардиомиоцитов на разных стадиях перестройки их сократительного аппарата 118
3.18. Перераспределение саркомерных белков -актинина и миозина
при перестройке сократительного аппарата кардиомиоцитов в культуре 119
Глава 4. Обсуждение 123
4.1. Влияние внеклеточного матрикса на сократительный аппарат кардиомиоцитов 123
4.2. Синтез кардиомиоцитами белков внеклеточного матрикса и матриксных металлопротеиназ 124
4.3. Смена изоформ актина в кардиомиоцитах в процессе перестройки их сократительного аппарата 128
4.4. Обратная корреляция между гладкомышечным актином и внеклеточным матриксом 132
Выводы 136
Список работ, опубликованных по теме диссертации 137
Список цитированной литературы
