Введение
Глава 1. Фермент аспартат-аммоний лиаза: распространнность и свойства 10
1.1. Биологическое разнообразие аспартаз 11
1.2. Структура фермента 13
1.3. Особенности каталитического механизма аспартазы 15
1.3.1. Субстраты и ингибиторы аспартазы 15
1.3.2. Активация ионами двухвалентных металлов и субстратом 16
1.3.3 Влияние температуры 18
1.3.4. Исследование активного центра фермента 19
1.3.5. Предполагаемый механизм действия 23
1.4. Протеолитическая активация аспартазы из E. coli 24
Глава 2. Применение аспартаз в промышленной биотехнологии 27
2.1. Использование аспартаз в качестве катализатора для получения L аспарагиновой кислоты 27
2.1.1. Способы получения L-аспарагиновой кислоты 30
2.1.2. Пути совершенствования биокатализаторов 35
2.2. Использование аспартазы из Haemophilus influenza 38
2.3. Роль аспартаз в биосинтезе аминокислот 39
Глава 3. Материалы и методы 42
3.1. Бактериальные штаммы, использованные в работе 42
3.2. Плазмидные вектора, использованные в работе 43
3.3. Олигонуклеотиды, использованные в работе 44
3.4. Работа с бактериальными культурами 44
3.4.1. Культивирование бактерий 44
3.4.2. Получение электрокомпетентных клеток 44
3.4.3. Трансформация электрокомпетентных клеток 45
3.4.4. Конструирование штаммов E. coli с помощью Red-зависимой рекомбинации 46
3.5. Манипуляции с нуклеиновыми кислотами 48
3.5.1. Выделение тотальной ДНК 48
3.5.2. Выделение плазмидной ДНК 48
3.5.3. Выделение РНК 49
3.5.4. Очистка фрагментов ДНК 49
3.5.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 49
3.5.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле 50
3.5.7. Количественная оценка ДНК, РНК 50
3.5.8. Рестрикция и лигирование 50
3.5.9. Проведение реакции обратной транскрипции, и амплификация ДНК в режиме реального времени 51
3.5.10. Секвенирование фрагментов ДНК 51
3.6. Манипуляции с белками 52
3.6.1. Измерение количества белка 52
3.6.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях 52
3.7. Определение аспартазной активности 52
3.8. Определение константы Михаэлиса 54
3.9. Определение содержания органических кислот методом ВЭЖХ 55
3.10. Иммобилизация клеток E. coli 55
3.11. Биоинформатические методы 56
Глава 4. Результаты и обсуждение 57
4.1. Клонирование и экспрессия генов аспартаз из различных источников. Сравнительное исследование каталитических свойств разных аспартаз 57
4.1.1. Клонирование и секвенирование гена аспартазы из Escherichia coli ВКПМ В-7188 57
4.1.2. Клонирование гена аспартазы из Bacillus sp. YM55-1 59
4.1.3. Клонирование гена аспартазы из Corynebacterium glutamicum 60
4.1.4. Сравнительное исследование генов аспартаз из Escherichia coli, Bacillus sp. YM55-1 и Corynebacterium glutamicum 61
4.1.5. Экспрессия генов аспартаз в клетках E. coli и их сравнительный анализ 64
4.2. Разработка генетических подходов к повышению аспартазной активности штамма Escherichia coli с использованием методов биоинженерии 70
4.2.1. Амплификация гена аспартазы в составе мультикопийных экспрессионных плазмид 70
4.2.2. Усиление экспрессии гена аспартазы в составе хромосомы за счет замены собственного промотора на сильный промотор 75
4.2.3. Получение мутантных вариантов аспартазы с измененным уровнем активности 77
4.3. Получение штаммов Escherichia coli с делетированными генами фумараз и изучение их каталитических свойств 80
4.3.1. Получение штаммов Escherichia coli с удаленными генами фумараз 81
4.3.2. Рост штаммов с удаленными генами фумараз 84
4.3.3. Транскрипционный анализ штаммов с удаленными генами фумараз 84
4.3.4. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием полученных штаммов 86
4.4. Создание промышленных биокатализаторов синтеза L-аспарагиновой кислоты на основе штаммов Escherichia coli с высокой аспартазной и сниженной фумаразной активностями 89
4.4.1. Создание штаммов для промышленных биокатализаторов 89
4.4.2. Рост и аспартазная активность полученных штаммов 90
4.4.3. Биосинтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония с использованием штаммов D12 PG25-aspA fumC(CS) и D13 PG25-aspA fumАC(CS) 91
4.4.4. Наработка биомассы штаммов в лабораторном ферментере и получение иммобилизованной формы биокатализаторов BD12 и BD13 93
4.4.5. Изучение каталитических свойств промышленных форм иммобилизованных биокатализаторов 94
4.5. Модификация аспартазной активности у Corynebacterium glutamicum и оценка их влияния на биосинтез лизина 96
4.5.1. Конструирование плазмиды для экспрессии гена aspA из E. coli в штаммах Corynebacterium glutamicum 96
4.5.2. Рост и аспартазная активность штамма C. glutamicum H115 pDL-4 97
4.5.3. Уровень синтеза лизина в штамме C. glutamicum H115 c повышенной аспартазной активностью 98
Заключение 101
Выводы 106
Список сокращений, использованных в работе 107
Список использованной литературы 108
Приложение А 117
Благодарности 123
