Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 История изучения туберозного склероза 13
1.2. Этиология и патогенез туберозного склероза и спорадической ангиомиолипомы почки 14
1.2.1. Туберозный склероз 14
1.2.2. Спорадическая ангиомиолипома почки 22
1.3. Продукты генов комплекса туберозного склероза 24
1.3.1. Ген TSC1 и его продукт - гамартин 24
1.3.2. Патогенные мутации в TBC1D7 не ассоциированы с туберозным склерозом 27
1.3.3. Ген TSC2 и его продукт - туберин 27
1.4. Белковый комплекс TSC и его роль в сигнальном пути mTOR 30
1.4.1. Канонический сигнальный путь TSC 30
1.4.2. Предполагаемый неканонический сигнальный путь TSC 32
1.5. Молекулярный патогенез туберозного склероза 32
1.5.1. Точковые мутации в генах TSC1 и TSC2 33
1.5.2. Протяженные делеции 34
1.6. Мозаицизм 35
1.7. Фено-генетические корреляции у больных туберозным склерозом 37
1.8. Генетика спорадической ангиомиолипомы почки 40
Глава 2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Характеристика выборки больных с диагнозом туберозный склероз 42
2.2. Характеристика выборки больных с диагнозом спорадическая ангиомиолипома почки 44
2.3. Методы исследования 44
2.3.1. Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови 44
2.3.2. Выделение геномной ДНК из опухолевого материала спорадической ангиомиолипомы почки 45
2.3.3. Анализ мутаций генов TSC1 и TSC2 46
2.3.4. Анализ мутаций в 409 генах в опухолевых образцах спорадической ангиомиолипомы почки 46
2.3.5. Высокопроизводительное параллельное секвенирование 46
2.3.6. Оценка клинической значимости нуклеотидных замен 47
2.3.7. Подтверждение мутаций, выявленных с помощью ВПС 47
2.3.8. Проведение полимеразной цепной реакции. 50
2.3.9. Проведение электрофореза в ПААГ 51
2.3.10. Секвенирование ДНК по Сэнгеру 51
2.3.11. Анализ изменений копийностей генов TSC1 и TSC2 методом мультиплексной амплификацией лигированных зондов (MLPA) 51
2.3.12. Анализ аллельного дисбаланса с помощью метода высокопроизводительного параллельного секвенирования 52
2.3.13. Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) 53
2.4. Статистическая обработка данных 53
Глава 3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Молекулярно-генетический анализ пациентов с диагнозом туберозный склероз 54
3.1.1. Распределение мутаций в генах TSC1 и TSC2 в исследуемой выборке пациентов с туберозным склерозом 54
3.1.2. Частота встречаемости разных типов мутаций в генах TSC1 и TSC2 54
3.1.3. Расположение обнаруженных мутаций в гене TSC1 56
3.1.4. Расположение обнаруженных мутаций в гене TSC2 58
3.1.5. Протяженные делеции в генах TSC1 и TSC2 60
3.1.6. “Горячие точки” в генах TSC1 и TSC2 60
3.1.7. Мозаичные патогенные варианты у пациентов с туберозным склерозом 62
3.1.8. Случаи туберозного склероза с не идентифицированными патогенными мутациями у пробандов 65
3.1.9. Впервые идентифицированные патогенные мутации при туберозном склерозе 65
3.2. Сегрегационный анализ выявленных точковых мутаций 67
3.2.1. Семейные и спорадические случаи туберозного склероза 68
3.3. Фено-генотипические корреляции у пациентов с туберозным склерозом 68
3.3.1. Фенотипическое описание выборки пациентов с туберозным склерозом 68
3.3.2. Фено-генотипические корреляции 70
3.4. Технология молекулярной диагностики туберозного склероза 83
3.4.1. Детальный алгоритм молекулярной диагностики туберозного склероза 83
3.4.2. Эффективность разработанной технологии 84
3.5. Молекулярно-генетическая характеристика спорадической ангиомиолипомы почки 84
3.5.1. Точковые мутации в образцах опухолевой ткани спорадической ангиомиолипомы почки 84
3.5.2. Аллельный дисбаланс области расположения гена TSC2 в образцах опухолевой ткани спорадической ангиомиолипомы почки, определенный методом высокопроизводительного параллельного секвенирования 86
3.5.3. Новые регионы с потерей гетерозиготности участков хромосом при спорадической ангиомиолипоме почки 88
3.5.4. Валидация участков алелльного дисбаланса, выявленных с помощью высокопроизводительного параллельного секвенирования, методом хромосомно-микроматричного анализа 88
3.5.5. Аллельная инактивация гена TSC2 в ткани спорадической ангиомиолипомы почки 92
3.5.6. Идентификация новых генов с мутациями в опухолевых образцах спорадической ангиомиолипомы почки 93
3.5.7. Случаи мимикрирования спорадической ангиомиолипомы почки 96
Заключение 99
Выводы 104
Практические рекомендации 106
Список работ, опубликованных по теме диссертации 107
Список литературы 110
