Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Биологическая активность рибонуклеаз 13
1.1.К Роль рибонуклеаз в регуляции экспрессии генов 16
1.1.2. Защитные функции рибонуклеаз 23
1.2. Цитотоксичные рибонуклеазы различных организмов 27
1.2.1. Механизмы цитотоксичности рибонуклеаз 32
1.2.2. Молекулярные детерминанты цитотоксичности рибонуклеаз 39
1.3. Иммуногенные эффекты рибонуклеаз 48
2. Материалы и методы исследований 52
2.1. Используемые в экспериментальной работе материалы 52
2.1.1. Ферментные препараты 52
2.1.2. Бактериальные штаммы 56
2.1.3. Клеточные культуры 57
2.2. Методы определения токсического и генотоксического действия РНКаз в прокариотических тест-системах 58
2.2.1. Оценка токсичности ферментных препаратов по выживаемости тестерных штаммов грамотрицательных и грамположительпых микроорганизмов 58
2.2.2. Оценка токсичности ферментных препаратов по ингибированию уровня конститутивных ферментов 59
2.2.3. Тестирование на мутагенность в бактериальных тест-системах.. 60
2.2.3.1. Тест Эймса на выявление генных мутаций 60
2.2.3.2. SOS-хромотест 61
2.3. Оценка жизнеспособности клеточных культур 61
2.4. Цитомстрическое определение апоптических клеток 62
2.5 Визуализация апоптических изменений клеток с помощью методов микроскопии 64
2.5.1. Микроскопическое исследование апоптических изменений клеточной морфологи и 64
2.5.2. Микроскопия с использованием витального окрашивания флуоресцентным красителем JC-1 64
2.5.3. Прямая регистрация уровня внутриклеточного Са с помощью флуорохромного агента FURA-2 64
2.6. Выявление двойных разрывов ДНК методом электрофореза в пульсирующем ноле 65
2.7. Цитометричсское исследование индукции нсспецифического иммунного ответа 66
2.8. Статистическая обработка результатов 67
3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Токсические и гепотоксическис эффекты микробных рибонуклеаз 68
3.1.1. Токсические эффекты рибонуклеаз 68
3.1.2. Индукция генных мутаций рибонуклеазами в тесте Эймса 69
3.1.3. SOS-индуцирующая активность рибонуклеаз 70
3.2. Апоптозиндуцирующее действие микробных рибонуклеаз на нормальные и малигнизированпые клетки эукариот 76
3.2.1. Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеаз на нормальные и опухолевые клетки крови 76
3.2.2. Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеаз на клетки солидных опухолей 87
3.3. Оценка жизнеспособности клеточных культур при росте в присутствии микробных РНКаз 90
3.4. Апоптотическис изменения морфологических и физиологических характеристик клеток под действием рибонуклеазы Bacillus intermedius 94
3.5. Рибонуклаза Bacillus intermedius как индуктор поликлопалыюго Т-клеточиого ответа 101
4. Заключение 103
Выводы 107
Список литературы 110
