Введение
Глава 1. Обзор литературы стр.10
1.1. Общие сведения о РНК-полимеразе и Транскрипционном цикле стр.10
1.2. Структурные особенности РНК-полимеразы стр.14
1.3. Структурно-функциональная модель активного центра РНК-полимеразы стр.27
1.3.1. Двуметаллический механизм катализа стр.27
1.3.2. Механизм катализа многосубъединичной РНКП стр.29
1.3.3. Характеристика реакции 3-5-экзонуклеазного расщепления стр.33
1.3.4. Влияние мутационных замен & fi-субъединице РНКП Е. cot/ на 3-5-экзонуклеазную активность стр.35
1.3.5. Молекулярное моделирование активного центра РНКП Е. Colt стр.38
1.4. Ингибиторы РНК-полимеразы. Антибиотики стр.42
1.4.1. Рифампицин стр.42
1.4.2. Тагетитоксин стр.49
1.4.3. Альфа-аманитин стр.53
1.4.4. Специфичность действия аманитина и тагетитоксина стр.56
14.5. Стрептолидигин стр.58
1.4.6, Липиармицин стр.60
1.4.7. МикроцинJ25 стр.62
14.8. Ингибиторы серии CBR703 стр.68
1.4.9. Дауномицин и марселломицин стр. 69
ГЛАВА2. Материалы и методы стр.72
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды стр.72
2.2. Полимеразы стр.72
2.3. Приготовление РНК-полимеразы из клеток стр.72
2.3.1. Выделение РНК-полимеразы E.coli стр.72
2.3.2. Выделение РНК-полимеразы Thermus aquaticus стр.74
2.4. Бактериальные среды стр.75
2.5. Электрофорез стр.76
2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) стр.76
2.7. Метод Ре2+-индуцированного расщепления белка стр.77
2.8. Радиоактивное мечение олигонуклеотидов стр.78
2.9. Транскрипция сТ7А1 промотора, абортивный синтез стр.78
2.10. Транскрипция на искуственных транскрипционных комплексах (нуклеиновокисл отных скаффолдах) стр.79
2.11. Эндонуклеотическое и экзонуклеотическое расщепление, пирофосфорол из стр.80
2.12. Измерение быстрых кинетик реакции элонгации стр,81
2.13. Определение скоростей реакций (Kobs ,Vmax) и константы Михаэлиса (Кт) стр.83
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение стр.85
3.1. Исследование механизма ингибирования бактериальной РНК-полимеразы антибиотиком стрептолидигином стр.85
3.1.1. Стрептолидигин ингибирует присоединение нуклеотида, разделяя злонгационноые комплексы на медленную и быструю фракции стр.86
3.1.2. Характеристика фракций элонгационных комплексов, образующихся в присутствии стрептолидигина стр.88
3.1.3. Стрептолидигин ингибирует внутреннее расщепление РНК, при этом также разделяя комплексы на медленную и быструю фракции стр.92
3.1.4. Присутствие стрептолидигина не изменяет значение Кмдпя входящего нуклеозидтрифосфата стр.93
3.1.5. Стрептолидигин замедляет некую стадию, предшедствующую синтезу фосфодиэфирной связи стр.95
3.1.6. Кристаллическая структура РНКП со связанным с ней стрептолидигином. Модель ингибирования РНКП стрептолидигином и функционирования активного центра РНКП стр.96
3.2. Изучение роли триады остатков аспарагиновой кислоты вдвуметаллическом механизме катализа в активном центре РНК-полимеразы стр.101
3.2.1 Замены остатков Asp в активном центре РНКП делают невозможной промотор-зависимую транскрипцию стр.104
3.2.2. Замены каталитических остатков Asp влияют на связывание /We2+ со свободной РНКП стр.105
3.2.3. Мутантные РНКП частично активны в элонгационном комплексе стр.107
3.2.4. Замены Asp лишь умеренно уменьшают кажущееся сродство каталитического центра к Ме2+ в транскрипционных комплексах стр .111
3.2.5. Расщепление транскрипта мутантными РНКП стр.114
Выводы стр.123
Список цитируемой литературы стр.124
Благодарности стр.142
