Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 11
1.1 Общая характеристика lysobacter spp 11
1.2 Клеточная оболочка бактерий
1.2.1 Структурные особенности клеточной оболочки грамположительных бактерий 17
1.2.2 Структурные особенности клеточной оболочки грамотрицательных бактерий 19
1.3 Внешнемембранные везикулы грамотрицательных бактерий 24
1.3.1 Структура везикул 26
1.3.2 Биогенез везикул 27
1.3.3 Функциональная значимость везикул 31
1.4 Бактериолитические ферменты 34
1.4.1 Автолизины и вирусные эндолизины 35
1.4.2 Внеклеточные бактериолитические ферменты 36
1.4.3 Специфичность бактериолитических ферментов 37
1.4.4 Структурно–функциональные особенности литических ферментов 40
1.4.5 Биомедицинское направление изучения литических ферментов 43
ГЛАВА 2 Материалы и методы 46
2.1 Бактериальные штаммы и условия культивирования 46
2.2 Получение везикул
2.2.1 Получение везикул методом дифференциального центрифугирования 47
2.2.2 пОлучение везикул методом осаждения (nh4)2so4
2.3 Фракционирование препарата везикул lysobacter sp. Xl1 в градиенте плотности сахарозы 47
2.4 Получение внешних мембран lysobacter sp. Xl1 48
2.5 Тонкослойная хроматография препаратов везикул и внешних мембран lysobacter sp. Xl1 48
2.6 Структурно–функциональная характеристика белков л1 и л5 lysobacter SP. XL1
2.6.1 Очистка рекомбинантных белков 49
2.6.2 Кристаллизация белков Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1 50
2.6.3 Изучение ингибирующего действия синтезированных пептидов на белок Л5 Lysobacter sp. XL1 50
2.6.4 Эксклюзионная хроматография 51
2.6.5 Электрофорез белков в нативных условиях 51
2.6.6 Получение литической протеазы Л5 из везикул Lysobacter sp. XL1 51
2.7 Изучение специфичности белка л5 lysobacter SP. XL1 52
2.7.1 Получение пептидогликана S. aureus 209P 52
2.7.2 Изучение специфичности действия белка Л5 по отношению к пептидогликану S. aureus 209P 52
2.7.3 Определение типа гидролизуемой связи белком Л5 в синтетическом субстрате Abz– Ala–Ala–Phe–pNA 53
2.8 Аналитические методы 53
2.8.1 Определение концентрации ЭПС 53
2.8.2 Определение концентрации белка методом Бредфорда 54
2.8.3 Определение концентрации общего белка методом Лоури 54
2.8.4 Измерение активности щелочной фосфатазы 54
2.8.5 Определение концентрации КДО 55
2.9 Электронная микроскопия 55
2.9.1 Негативное контрастирование 55
2.9.2 Электронно–микроскопическая иммуноцитохимия
2.10 Электрофорез белков в денатурирующих условиях 56
2.11 Иммуноблоттинг белков 56
2.12 Конструирование антимикробных препаратов на основе белка л5 lysobacter SP. XL1
2.12.1 Конструирование липосомальных препаратов на основе фосфолипидов везикул и белка Л5 Lysobacter sp. XL1 57
2.12.2 Конструирование препарата на основе ЭПС и белка Л5 Lysobacter sp. XL1
2.13 Измерение бактериолитической ативности препаратов 58
2.14 Определение литического действия препаратов методом спот–теста 58
ГЛАВА 3 Результаты исследования 60
3.1 Изучение факторов биогенеза везикул lysobacter SP. XL1 60
3.1.1 Изучение роли белка Л5 в биогенезе везикул 60
3.1.2 Изучение роли фосфолипидов в биогенезе везикул Lysobacter sp. XL1 68
3.2 Структурно–функциональная характеристика белков л1 и л5 lysobacter SP. XL1 70
3.2.1 Получение рекомбинантных белков Л1 и Л5 для кристаллизации 71
3.2.2 Сравнительная структурная характеристика белков Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1 71
3.2.3 Изучение способности литической протеазы Л5 Lysobacter sp. XL1 агрегировать в амилоидоподобные фибриллы 77
3.2.4 Изучение специфичности белка Л5 Lysobacter sp. XL1 77
3.3 Конструирование антимикробных препаратов на основе литического белка л5 lysobacter sp. XL1 81
3.3.1 Конструирование антимикробных препаратов на основе ЭПС и белка Л5 Lysobacter sp. XL1 81
3.3.2 Конструирование антимикробных препаратов на основе фосфолипидов везикул и белка Л5 Lysobacter sp. XL1 83
3.3.3 Изучение лечебного действия антимикробного препарата на основе белка Л5 и ЭПС ГЛАВА 4 Обсуждение результатов 86
Выводы 94
Список литературы 95
