Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Антимикробные пептиды (АМП) 8
1.1.1. Классификация АМП 8
1.1.2. Механизм действия АМП 15
1.1.3. Механизмы возникновения резистентности микроорганизмов к АМП 18
1.1.4. Терапевтическое применение АМП 20
1.1.5. АМП из яда паука Lachesana tarabaevi
1.1.5.1. Латарцины 24
1.1.5.2. Цито-инсектотоксины 27
1.2. Системы регуляции экспрессии генов 30
1.2.1. Молекулярные механизмы тетрациклин-зависимой системы регуляции экспрессии 30
1.2.2. Фармакология доксициклина 34
1.3. Особенности жизненного цикла Chlamydia trachomatis 35
2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Материалы 39
2.1.1. Штаммы E. coli 39
2.1.2. Плазмидные векторы 39
2.1.3. Реактивы и антибактериальные препараты 39
2.2. Методы 39
2.2.1. Реакция рестрикции 39
2.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 40
2.2.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 40
2.2.4. Реакция лигирования 40
2.2.5. Конструирование векторов 40
2.2.6. Культивирование клеток E. coli 42
2.2.7. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК 42
2.2.8. Выделение плазмидной ДНК методом кипячения 43
2.2.9. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 2.2.10. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК 43
2.2.11. Препаративное выделение плазмидной ДНК 43
2.2.12. Химический синтез пептидов. Определение концентрации полипептидов. УФ-спектрофотометрия 44
2.2.13. Тестирование антимикробной активности пептидов на E.coli 44
2.2.14. Культивирование линий клеток млекопитающих 44
2.2.15. Культивирование штамма C. trachomatis 45
2.2.16. Определение антихламидийной активности пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi 45
2.2.17. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) доксициклина на C. trachomatis 45
2.2.18. Трансфекция клеток линии HEK293 46
2.2.19. Заражение линии клеток HEK293 C. trachomatis 46
2.2.20. Выявление включений C. trachomatis 46
2.2.21. Конфокальная микроскопия 46
2.2.22. Определение титра C. trachomatis 47
2.2.23. Анализ жизнеспособности клеток 47
2.2.24. Выделение суммарной РНК из линии клеток HEK293, зараженной C. trachomatis 47 2.2.25. Реакция обратной транскрипции 48
2.2.26. Транскрипционный анализ 48
2.2.27. Протеомный анализ 48
2.2.28. Дополнительное программное обеспечение 50
2.2.29. Статистика 50
3. Результаты 51
3.1. Антимикробные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi 51
3.2. Антибактериальная активность пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi на E. coli in vitro 51
3.3. Антимикробный эффект латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a на C. trachomatis 52
3.4. Получение плазмидных конструкций, экспрессирующих гены латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a из яда паука Lachesana tarabaevi 53
3.5. Регуляция экспрессии генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, в клетках млекопитающих 57
3.6. Антихламидийная активность латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a из яда пауков при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HEK293 59
3.7. Транскриптомный анализ клеток линии HEK293 при экспрессии гена цито-инсектотоксина cit1a 60
3.8. Протеомный анализ линии клеток HEK293 при экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a 63
3.9. Влияние экспрессии гена цито-инсектотоксина cit1a на ингибирование инфекции C. trachomatis на разных фазах жизненного цикла 67
4. Обсуждение 72
Заключение 86
Выводы 88
Список сокращений 89
Список литературы
