Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Перспективы глубокой переработки зерна в России 7
1.2. Перспективы микробиологического получения органических кислот 8
1.3. Лимонная кислота, её характеристика и применение 13
1.4. Продуценты ЛК 17
1.5. Селекция продуцентов 25
1.6. Условия биосинтеза лимонной кислоты у дрожжей Y. lipolytica 31
1.7. Механизм биосинтеза лимонной кислоты у дрожжей Y. lipolytica 35
1.8. Глюкоза - субстрат для микробных трансформаций 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 43
2.2. Культивирование дрожжей
2.2.1. Состав и подготовка основной среды 43
2.2.2. Подготовка посевного материала 4 4
2.2.3. Методы культивирования дрожжей 4 4
2.3. Метод получения мутантов – активных продуцентов лимонной кислоты 46
2.3.1. Получение мутантов при облучении ультрафиолетом (УФ) 46
2.3.2. Индукции мутаций нитрозогуанидином (НГ) 46
2.3.3. Состав питательных сред для скрининга мутантов 47
2.4. Аналитические методы 47
2.4.1. Методы контроля роста дрожжей 47
2.4.2. Определение концентрации глюкозы 48
2.4.3. Определение концентрации органических кислот 49
2.4.4. Определение концентрации ЛК химическим методом 49
2.4.5. Определение трео-Ds-изолимонной кислоты энзиматическим методом 50
2.4.6. Анализ содержания азота 51
2.4.7. Определение содержания белка
2.5. Методы расчета технологических параметров ферментации 52
2.6. Определение активности ферментов з
2.6.1. Получение бесклеточных экстрактов 53
2.6.2. Методы определения активности ферментов 53
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Отбор продуцента и условий культивирования, оптимальных 55 для получения ЛК из глюкозы
3.2. Получение мутантных штаммов Y. lipolytica с применением УФ- 60 облучения и N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидина
3.2.1. Обработка Y. lipolytica ВКМ Y-2373 ультрафиолетовым облучением (УФ) 60
3.2.2. Обработка Y. lipolytica ВКМ Y-2373 с N-метил-N -нитро-N- 61 нитрозогуанидином (НГ)
3.2.3. Отбор продуцентов
3.2.3.1. Селективная работа на средах с ацетатом и цитратом 64
3.2.3.2. Отбор продуцентов на твердой среде с мелом или индикатором 65 бромкрезоловым зеленым
3.2.4. Отбор продуцентов в жидкой среде 69
3.3. Получение мутантов с применением комбинированного мутагенеза 70 и оценка их кислотообразующей активности
3.4. Характеристика мутанта Y. lipolytica № 15 76
3.5. Биосинтез лимонной кислоты у Y.lipolytica №15 из глюкозы в ферментере 77
3.6. Способы культивирования, обеспечивающие продолжительный и 80 стабильный синтез ЛК из глюкозы у мутанта Y.lipolytica № 3.6.1. Использование мембранного модуля для биосинтеза ЛК 81
3.6.2. Отъемно-доливной метод культивирования 84
3.7. Особенности роста мутанта Y. lipolytica № 15 и синтеза ЛК при 88
использовании рапсового масла в качестве источника углерода
3.8. Проверка синтезирующей активности мутанта Y. lipolytica № 15 на средах 98
с ферментолизатом осины в колбах
3.9 Аминокислотный состав биомассы продуцента 101
Заключение 106
Выводы 110
Список сокращений и условных обозначений
Список литературы
