Введение
Глава I. Обзор литературы 8
1.1 Значение вакцинации для профилактики вирусных инфекций 8
1.2 Типы противовирусных вакцин 10
1.3 Механизмы презентации антигенов Т-клеткам 12
1.4 Вакцины на основе частиц
1.4.1 Материалы для создания партикулярных вакцин 15
1.4.2 Влияние размера и заряда частиц на захват антиген-презентирующими клетками 17
1.5 Хитозан и его применение в биомедицинских исследованиях 22
1.5.1 Хитин и хитозан 22
1.5.2 Характеристики хитозана, их влияние на биологическую активность и изменение свойств путем химической модификации 23
1.6 Применение частиц на основе хитозана и других полимеров для разработки вакцин 28
1.6.1 Влияние упаковки антигена в нано- и микроструктуры на длительность защитного эффекта и иммунного ответа 29
1.6.2 Влияние метода иммунизации 31
1.6.3 Введение агонистов паттерн-распознающих рецепторов 33
1.6.4 Влияние размера и заряда частиц на эффективность ответа 35
Глава II. Экспериментальная часть 38
2.1 Реагенты и растворители 38
2.2 Лабораторное оборудование 39
2.3 Выделение белков и исследование биологической активности лактоферрина
2.3.1 Выделение -лактоглобулина (ЛГ) из сыворотки коровьего молока 40
2.3.2 Выделение лактоферрина 40
2.3.3 Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле 41
2.3.4 ВЭЖХ анализ белков молочной сыворотки и оценка чистоты выделенного лактоферрина 41
2.3.5 Исследование аутентичности белка методом двойной радиальной иммунодиффузии 42
2.3.6 Получение апо-лактоферрина 42
2.3.7 Метод атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-АЭС) 42
2.3.8 Метод количественного колориметрического определения содержания железа в белке по реакции с динатриевой солью 3-(2-пиридил)-5,6-бис(4-сульфофенил)-1,2,4-триазина (феррозином) без депротеинизации 43
2.3.9 Определение рибонуклеазной активности лактоферрина 43
2.3.10 Метод ингибирования перекисного окисления липидов 44
2.3.11 Определение антимикробной и антимикотической активности
лактоферрина 44
2.4 Подготовка образцов хитозана и синтез его производных 45
2.4.1 Переосаждение хитозана 45
2.4.2 Кислотный гидролиз хитозана 45
2.4.3 Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана 45
2.4.4 Высокоэффективная гель-проникающая хроматография 46
2.4.5 Определение степени дезацетилирования хитозана (СД) методом кондуктометрического титрования 47
2.4.6 Определение степени дезацетилирования хитозана и степени замещения его производных методом протонного ядерного магнитного резонанса (1Н-NMR) 47
2.4.7 Синтез N-гексаноилхитозана 48
2.4.8 Синтез N-сукцинилхитозана 48
2.4.9 Синтез N-[2-(3)-(додец-2 -ен-1 -ил)сукцинил]хитозана. 48
2.5 Формирование и характеристика частиц 49 2.5.1 Формирование частиц на основе лактоферрина и сукцинилхитозана методом термической обработки 49
2.5.2 Получение производных хитозана и белков, а также частиц меченых флуоресцеином изотиоцианатом 50
2.5.3 Определение белка по методу Бредфорд 50
2.5.4 Определение содержания белка в частицах методом флуоресцентной спектрофотометрии 50
2.5.5 Высвобождение белка из частиц 50
2.5.6 Метод динамического светорассеяния (ДСР) 51
2.5.7 Атомно-силовая микроскопия (АСМ) 51
2.6 Исследования in vitro 51
2.6.1 Исследование цитотоксичности частиц и производных хитозана 51
2.6.2 Исследование захвата производных хитозана и частиц клетками методом проточной цитометрии 52
2.6.3 Анализ захвата частиц клетками методом конфокальной микроскопии 52
2.7 Исследования in vivo 53
2.7.1 Иммунизация мышей 53
2.7.2 Иммуноферментный анализ 53
2.7.3 Исследование клеточного состава лимфатических узлов и селезенки 54
2.7.4 Анализ пролиферации клеток 54
Глава III. Результаты и их обсуждение
3.1 Выделение белков из молочной сыворотки 56
3.2 Исследование биологических свойств полученного препарата лактоферрина
3.2.1 Рибонуклеазная активность ЛФ 62
3.2.2 Определение антимикробной активности лактоферрина 63
3.2.3 Исследование антиоксидантной активности лактоферрина методом ингибирования перекисного окисления липидов 64
3.3 Получение низкомолекулярного хитозана и синтез производных хитозана 66
3.4 Получение и физико-химические свойства частиц содержащих белок, инкапсулированный в полисахаридную матрицу на основе хитозана и его производных
3.4.1 Формирование частиц методом контролируемой термической обработки 68
3.4.2 Введение полисахаридов в состав частиц 74
3.4.3 Влияние ПЭГ на частицы 77
3.4.4 Введение незаряженных полисахаридов в частицы
3.4.4 Характеристика частиц методами атомно-силовой микроскопии и динамического светорассеяния 82
3.4.5 Высвобождение антигена из частиц in vitro
3.5 Исследование взаимодействия частиц с клетками макрофагов 87
3.6 Внутриклеточный транспорт производных хитозана 92
3.7 Внутриклеточный транспорт частиц 96
3.8 Токсичность частиц 98
3.9 Исследование иммунного ответа
3.9.1 Гуморальный иммунный ответ 100
3.9.2 Характеристика типа клеточного иммунного ответа 102
3.7.1 Механизмы кросс-презентации СХ-ГМ-ЛФ и СХ-ЛФ-Х 107
Выводы 110
Заключение 112
Список сокращений 112
Список работ, опубликованных по теме диссертации 115
Благодарности 118
Список литературы
