Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Растения как платформа для биофарминга 11
1.2 Общая характеристика Lemna minor L 20
1.3 Генетическая трансформация ряски 22
1.4 Рекомбинантные вакцины растительного происхождения 23
1.5 Адъюванты 33
1.6 Вирус гриппа 37
1.7 Организация генома вирусов гриппа типа А 40
1.8 Характеристика белка М2 45
1.9 Использование пептида М2е для создания универсальной противогриппозной вакцины 49
2 Материалы и методы 56
2.1 Используемые штаммы и плазмиды 56
2.2 Оптимизация кодонного состава. Сборка синтетических
олигонуклеотидов 57
2.3 Молекулярное клонирование фрагментов ДНК 59
2.4 Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля 61
2.5 Трансформация Escherichia coli 61
2.6 Перенос плазмидной ДНК в штаммы Agrobacterium tumefaciens 62
2.7 Выделение плазмидной ДНК из клеток Escherichia coli 62
2.8 Электрофоретический анализ ДНК 62
2.9 Трансформация растений табака 63
2.10 Трансформация растений ряски 64
2.11 Выделение тотальной ДНК из растительных тканей 64
2.12 ПЦР - анализ растительной ДНК 65
2.13 Выделение тотальной РНК из растительных тканей и ОТ-ПЦР - анализ трансгенных растений 65
2.14 Гистохимический анализ трансгенных растений 66
2.15 Выделение общего растворимого белка из растительных тканей 66
2.16 Определение количества белка в растительных препаратах 2.17 Вестерн-блот анализ общего растворимого белка трансгенных растений 67
2.18 Количественный иммуноферментный анализ слитого белка М130--глюкуронидаза в трансгенных растениях 67
2.19 Оценка содержания субъединицы Б рицина в растительных экстрактах с помощью асиалофетуина 68
2.20 Экспрессия субъединицы Б рицина в бактериальной системе 70
3 Результаты и обсуждения 71
3.1 Сравнительный анализ кодонного состава вируса гриппа А H5N1 и растений ряски 71
3.2 Оптимизация кодонного состава 5 -концевой последовательности гена М2 вируса гриппа птиц H5N1. Синтез и сборка олигонуклеотидов 75
3.3 Клонирование 5 - фрагмента гена М2 в векторе pUC19 и в растительном экспрессионном векторе pBI121 77
3.4 Трансформация растений табака Nicotiana tabacum вектором pBIМ2, анализ трансгенных растений 79
3.5 Клонирование гена М143 в трансляционном слиянии с геном глюкуронидазы. Анализ экспрессии слитой последовательности
М143 - -глюкуронидаза в трансгенных растения табака 83
3.6 Клонирование последовательностей М130 и М122 в трансляционном слиянии с геном - глюкуронидазы. Анализ экспрессии слитых генов в трансгенных растения табака 89
3.7 Клонирование гена субъединицы Б рицина Ricinus communis
в векторе pUC18. 95
3.8 Клонирование последовательности М130 в растительном экспрессионном векторе pBI121 в трансляционном слиянии с 5 -концом гена хитинсвязывающего домена (CBD) и 3 –концом последовательности субъединицы Б рицина 100
3.9 Клонирование сигнального пептида белка табака PR1а 103
3.10 Клонирование и экспрессия гена субъединицы Б рицина (RTB) в бактериальной системе 108
3.11 Получение и анализ трансгенных растений табака, содержащих последовательность слитого гена RTB-M130 112
3.12 Анализ экспрессии гена пептида М2е в трансгенных растениях ряски 120
3.12.1 Анализ экспрессии слитого гена пептид М2е- -глюкуронидаза 121
3.12.2 Анализ экспрессии последовательности пептида М2е
слитой с субъединицей Б рицина 127
4 Заключение 135
5 Выводы 137
6 Список использованной литературы 138
