Введение
Обзор литературы 17
Биодеградация углеводородов нефти, методы и биопрепараты для очистки
окружающей среды от нефтяных загрязнений 17
Глава 1. Деградация углеводородов нефти 17
1.1 Нефть как источник загрязнений окружающей среды 17
1.2 Абиотическая деструкция нефти 19
1.3 Микробная деградация нефти 20
Глава 2. Плазмиды биодеградации 29
2.1. Плазмиды биодеградации парафинов и циклопарафинов 30
2.2. Плазмиды биодеградации ароматических углеводородов 32
2.3. Мобильные генетические элементы в составе плазмид 37
Глава 3. Распространение катаболических плазмид в природе 43
3.1. Конъюгационный перенос катаболических плазмид и трансформация 43
3.2 Мониторинг бактериальных штаммов
3.3 Факторы, влияющие на перенос катаболических плазмид и деградацию поллютантов 57
Глава 4. Хемотаксически активные микроорганизмы-деструкторы 63
Глава 5. Виды и особенности синтеза биологических поверхностно-активных веществ 69
5.1 Классификация биологических поверхностно-активных
Глава 6. Методы биоремедиации территорий, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами 75
6.1 Активация аборигенных микроорганизмов (биостимуляция) 77
6.2 Интродукция микроорганизмов-деструкторов (биоаугментация) 83
Глава 7. Биопрепараты для очистки от нефтяных загрязнений: принципы разработки и применения 90
7.1 Разработка биопрепаратов 90
7.2 Применение биопрепаратов 94
7.3 Коммерческие препараты на основе углеводородокисляющих микроорганизмов
для очистки почвенных и водных экосистем от нефти и нефтепродуктов 97
7.4 Проблема сохранения жизнеспособности микроорганизмов в составе
биопрепаратов 102
Глава 8. Фиторемедиационные технологии 108
8.1 Фитоэкстракция 111
8.2 Ризофильтрация 111
8.3 Фитодеградация 112
8.4 Фитоволатилизация 113
8.5 Фитогидравлика 113
8.6 Ризодеградация 114
8.7 Роль микроорганизмов в процессе фиторемедиации загрязненной окружающей
среды 115
8.8 Популяционные взаимодействия микроорганизмов 117
8.9 Растительно-микробные взаимодействия 117
2. Материалы и методы 120
2.1. Бактериальные штаммы
2.1.1. Питательные среды, источники углерода и энергии, антибиотики 120
2.1.2. Условия культивирования 122
2.3. Световая микроскопия 125
2.4. Электронно-микроскопические методы 126
2.5. Статистическая обработка результатов 126
2.6. Элиминация бактериальных плазмид 126
2.7. Коньюгационный перенос бактериальных плазмид 127
2.8. Трансформация клеток Е.соїі плазмидной ДНК 127
2.9. Определение стабильности признаков утилизации нафталина и салицилата..1 2.10. Выделение тотальной ДНК микроорганизмов. 128
2.11. Выделение плазмидной ДНК 128
2.12. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 129
2.13. Полимеразная цепная реакция 129
2.14. RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) анализ 130
2.15. Разделение амплифицированных фрагментов ДНК. 131
2.16. Электрофорез в агарозном геле 131
2.17. Определение активностей ключевых ферментов деградации нафталина 131
2.18. Определение концентрации белка 132
2.19. Измерение индекса эмульгирования 132
2.20. Измерение эмульгирующей активности 133
2.21. Измерение поверхностного натяжения 133
2.22. Измерение содержания гликолипидных биоПАВ 133
2.23. Очистка биоПАВ методом колоночной хроматографии 134
2.24. Тонкослойная хроматография гликолипидов 135
2.25. Анализ биоПАВ методом масс-спектрометрии 135
2.26. Анализ биоПАВ методом инфракрасной спектроскопии 135
2.27. Условия проведения периодического культивирования в ферментёре 135
2.28. Хранение микроорганизмов 136
2.29. Лиофилизация 137
2.30. Контактная сушка 137
2.31. Приготовление модельных почвенных систем 137
2.32.Внесение инокулята в почву в лабораторных модельных системах 138
2.33. Отбор проб для определения общей числености микроорганизмов и содержания нефти 138
2.34. Определение концентрации нафталина в почвенных экстрактах 138
2.35. Определение концентрации салицилата в культуральной жидкости 139
2.36. Мониторинг штаммов-деструкторов в процессе деградации нефти в модельных почвенных системах 139
2.37. Модельный полевой эксперимент с опытным образцом биопрепарата «МикроБак» 140
2.38. Полевые испытания опытного образца биопрепарата «МикроБак» 140
2.39. Гнотобиотическая система для выращивания растений 140
2.40. Полевые испытания растительно-микробной ассоциации «ВиО» — ячмень 141
3. Результаты 142
3.1 Изучение и характеристика активных микроорганизмов-деструкторов углеводороды нефти 142
3.1.1. Выбор и характеристика активных микроорганизмов, способных разлагать углеводороды нефти при пониженных температурах в присутствии соли 142
3.1.2 Выбор и характеристика микроорганизмов-нефтедеструкторов по способности к деградации высоких концентраций нефти при повышенных концентрациях морской соли и в широком температурном и рН-диапазонах 154
3.2. Влияние катаболических плазмид на биодеградацию углеводородов нефти... 164 3.2.1. Биодеградация нефти бесплазмидными и плазмидосодержащими микроорганизмами - деструкторами полициклических ароматических углеводородов в жидкой минеральной среде 164
3.2.2. Биодеструкция нефти бесплазмидными бактериями и плазмидосодержащими штаммами-деструкторами моноциклических ароматических углеводородов в жидкой минеральной среде 169
3.2.3. Роль плазмид биодеградации нафталина, толуола и камфары в процессе биодеградация нефти в жидкой минеральной среде 176
3.2.4. Роль плазмид биодеградации ПАУ в процессе биодеградация нефти в модельных почвенных системах 181
3.3 Роль горизонтального переноса катаболических плазмид в процессе биодеградации ПАУ 185
3.3.1. Конструирование маркированных штаммов деструкторов P. putida KT2442(pNF142::Tc) и P. putida BS394(pNF142::Tc) 185
3.3.2. Определение удельной скорости роста штаммов-деструкторов на нафталине 187
3.3.3. Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в лабораторных условиях 188
3.3.4 Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в почве в открытой окружающей среде 200
3.4 Образование биологических ПАВ бактериями - эффективными нефтедеструкторами 205
3.4.1 Характеристика способности микроорганизмов-нефтедеструкторов к продуцированию биоПАВ 205
3.4.2 Выделение биоПАВ, продуцируемых микроорганизмами-нефтедеструкторами 3.4.3 Особенности структуры биоПАВ 215
3.5 Составление ассоциаций микроорганизмов, перспективных для использования в составе биопрепаратов 220
3.5.1 Составление и отбор ассоциаций микроорганизмов, способных к деградации углеводородов нефти при пониженной температуре 220
3.5.2 Составление ассоциации штаммов, способных к деградации высоких концентраций нефти в широком температурном и рН диапазонах 223
3.6 Сравнительная эффективность деструкции нефти и дизельного топлива опытными образцами биопрепаратов «МикроБак», «ВиО» и биопрепаратом «Биооїїл» в жидкой минеральной среде 227
3.7 Сравнительная эффективность деструкции нефти опытными образцами биопрепаратов «МикроБак», «ВиО» и биопрепаратом «Биоойл» в лабораторном почвенном эксперимент. 231
3.8 Раздельное и совместное культивирование микроорганизмов-нефтедеструкторов 3.9 Получение различных форм микробной биомассы и её хранение. 238
Сохранение жизнеспособности и деградативной активности микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов. 238
3.9.1 Кратковременное хранение микроорганизмов-нефтедеструкторов в жидкой форме 238
3.9.2. Длительное хранение микроорганизмов-нефтедеструкторов 241
3.9.3 Новый способ получения сухой формы биопрепарата методом контактной сушки 245
3.10 Мониторинг интродуцированных в лабораторные модельные системы и открытую окружающую среду штаммов-нефтедеструкторов 247
3.11 Применение опытного образца биопрепарата «МикроБак» для биоремедиации почвы, загрязненной нефтью, в условиях полевого эксперимента
3.11.1. Изменение численности микробных популяций в почве 250
3.11.2. Мониторинг интродуцированной микробной ассоциации 252
3.11.3. Убыль нефти в полевом эксперименте 2 3.12 Полевые испытания опытного образца биопрепарата «МикроБак» по очистке грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами на территории ОАО «Тульская Топливно-Энергетическая Компания» 256
3.13 Разработка растительно-микробных ассоциаций для биоремедиации нефтезагрязненных почв и оценка их эффективности при деградации нефти в стерильных модельных почвенных системах 2 3.13.1 Скрининг растений для составления эффективной растительно-микробной ассоциации 259
3.13.2 Влияние микроорганизмов, входящих в состав ассоциации «ВиО» на рост растений в условиях загрязнения почвы нефтью 261
3.13.3 Динамика численности интродуцированных штаммов-деструкторов углеводородов нефти 262
3.13.4 Деградация нефти микробно-растительными ассоциациями 265
3.14 Оценка эффективности деградации нефти в нестерильных модельных
почвенных системах, содержащих растительно-микорбные ассоциации 265
3.14.1 Влияние микробной ассоциации «ВиО» на рост ячменя в условиях
загрязнения почвы нефтью 265 3.14.2 Динамика численности микроорганизмов в составе растительно-микробных ассоциаций в ризосфере и ризоплане растений 267
3.14.3 Убыль нефти при использовании растительно-микробной ассоциации в нестерильных модельных системах 268
3.15 Полевые испытания растительно-микробной ассоциацией «ВиО» — ячмень и
коммерческих биопрепаратов ЗАО «Биоойл»в условиях реального разлива нефти
3.15.1 Влияние биопрепаратов «ВиО» «Биоойл-СН» и «Биоойл-Югра» на рост ячменя в условиях реального разлива нефти 269
3.15.2 Численность микроорганизмов-деструкторов в почве и на корнях ячменя в условиях реального разлива нефти 269
3.15.3 Степень деструкции нефти биопрепаратами «ВиО», «Биоойл-СН» и «Биоойл-Югра», ассоциированными с ячменем в условиях реального разлива нефти271
3.16 Депонирование штаммов, изучение их патогенности, патенты и товарный знак 3.16.1. Депонирование штаммов 272
3.16.2 Изучение патогенности микроорганизмов 273
3.16.3 Патенты и товарный знак 273
3.16.4 Биопрепарат «МикроБак»: тосиколого-гигиеническая экспертиза, Технические условия, Экспертное заключение Роспотребнадзора и Сертификат соответствия 275
4. Обсуждение 277
4.1 Изучение и характеристика активных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти 277
4.1.1. Выбор и характеристика активных микроорганизмов, способных разлагать углеводороды нефти при пониженных температурах 277
4.1.2 Выбор и характеристика микроорганизмов-нефтедеструкторов по способности к деградации высоких концентраций нефти, при повышенных концентрациях морской соли и в широком диапазоне рН 284
4.2 Влияние катаболических плазмид на биодеградацию углеводородов нефти... 287
4.3 Роль горизонтального переноса катаболических плазмид в процессе биодеградации ПАУ 2 4.3.1 Конструирование маркированных штаммов-деструкторов P. putida KT2442(pNF142::TnMod-OTc) и P. putida BS394(pNF142::TnMod-OTc) для изучения горизонтального переноса плазмид биодеградации нафталина 290
4.3.2 Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в почве в лабораторных условиях 291 4.3.3 Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в почве в
открытой окружающей среде 296
4.4 Особенности образования биологических ПАВ, продуцируемых бактериями-эффективными нефтедестукторами 300
4.4.1 Способность микроорганизмов-нефтедеструкторов к продуцированию биоПАВ 300
4.4.2 Определение особенностей строения биосурфактантов 303
4.5 Составление и отбор ассоциаций микроорганизмов, перспективных для использования в составе биопрепаратов 305
4.5.1 Составление и отбор ассоциаций микроорганизмов, способных к деградации углеводородов нефти при пониженной температуре 306
4.5.2 Составление ассоциации штаммов, способных к деградации высоких концентраций нефти в широком температурном и рН диапазонах
3 4.6 Сравнительная эффективность деструкции нефти и дизельного топлива опытными образцами биопрепаратов «МикроБак», «ВиО» и биопрепаратом «Биооїїл» в жидкой минеральной среде 312
4.7 Сравнительная эффективность деструкции нефти опытными образцами биопрепаратов «МикроБак», «ВиО» и биопрепаратом «Биоойл» в лабораторном почвенном эксперимент. 314
4.8 Раздельное и совместное культивирование микроорганизмов-нефтедеструкторов
4.9 Получение различных форм микробной биомассы и её хранение. Сохранение жизнеспособности и деградативной активности микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов
4.10 Мониторинг интродуцированных в окружающую среду штаммов-нефтедеструкторов 331
4.11 Применение опытного образца биопрепарата «МикроБак» для биоремедиации почвы, загрязненной нефтью, в условиях полевого эксперимента 334
4.12 Полевые испытания опытного образца биопрепарата «МикроБак» по очистке грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами на территории ОАО «Тульская Топливно-Энергетическая Компания» 338
4.13 Разработка растительно-микробных ассоциаций для биоремедиации нефтезагрязненных почв и оценка их эффективности при деградации нефти в стерильных модельных почвенных системах 339
4.14 Оценка эффективности деградации нефти в нестерильных модельных почвенных системах, содержащих растительно-микробные ассоциации 342
4.15 Полевые испытания растительно-микробной ассоциацией «ВиО» — ячмень и коммерческих биопрепаратов ЗАО «Биоойл»в условиях реального разлива нефти
Заключение 345
Выводы 351
Список основных публикаций автора по теме диссертации 353
Экспериментальные статьи в рецензируемых журналах 353
Обзоры и главы в научных книгах 357
Изобретения и патенты 3578
Статьи в научных сборниках и других изданиях 359
Литература
