Введение
ГЛАВА 1. Использование кальций-регулируемых фотопротеинов в качестве репортеров в диагностики in vitro 12
1.1. Использование Са -регулируемых фотопротеинов в иммуноферментном анализе 14
1.2. Использование Са -регулируемых фотопротеинов в гибридизационном анализе 22
1.3. Одновременный анализ двух мишеней 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
2.1. Оборудование 36
2.2. Материалы и реактивы 36
2.3. Культивирование трансформированных клеток Е. coli, выделение и очистка белков 38
2.4. Определение концентрации белков, биолюминесцентной активности и спектральные измерения 40
2.5. Химическая модификация белков и олигонуклеотидов 41
ГЛАВА 3. Одновременный иммуноферментный анализ двух антигенов с использованием «цветных» мутантных форм обелина в качестве меток 43
3.1. Основные физико-химические свойства мутантных форм обелина W92F;H22E и Y138F 43
3.2. Одновременный твердофазный иммуноанализ двух антигенов 53
ГЛАВА 4. Последовательный иммуноферментный анализ двух антигенов с использованием фотопротеина обелина в паре с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa 58
4.1. Основные физико-химические свойства люциферазы Metridia longa 58
4.2. Использование люциферазы MLuc39 в твердофазном микроанализе 66
ГЛАВА 5. Гибридизационный био люминесцентный анализ с использованием фотопротеина обелина 72
5.1. Гибридизационный анализ с использованием в качестве метки коньюгата стрепт/авидина с обелином или щелочной фосфатазой 73
5.2. Гибридизационный анализ с использованием в качестве метки коньюгата олигонуклеотидного зонда с обелином или его мутантными вариантами Y138F и W92F;H22E 80
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 88
ВЫВОДЫ 91
ЛИТЕРАТУРА 93
