Введение
ГЛАВА 1. Бактериолитические ферменты 14
1.1. Распространенность бактериолитических ферментов в природе 14
1.2. Внутриклеточные (автол итичес кие) бактериолитические ферменты 16
1.2.1. Свойства автолитических ферментов 17
1.3. Внеклеточные бактериолитические ферменты 19
1.4. Внеклеточные бактериолитические комплексы 19
1.5. Субстратная специфичность бактериолитических ферментов 21
ГЛАВА 2. Структура клеточной стенки бактерий -субстрата бактериолитических ферментов 23
2.1. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий 26
2.2. Клеточная стенка грамиоложительных бактерий 27
2.3. Строение пептидогликана бактерий 29
ГЛАВА 3. Покоящиеся формы бактерий 37
3.1. Спорообразующие бактерии 39
3.1.1. Классификация спорообразующих бактерий 40
3.1.1.1. Анаэробные спорообразующие бактерии 40
3.1.1.2. Аэробные спорообразующие бактерии 41
3.1.2. Жизненный цикл спорообразующих бактерий 49
3.1.2.1. Характеристика бактериальных эндоспор 54
ГЛАВА 4. Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза 66
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 68
ГЛАВА 5. Материалы и методы 69
5.1. Материалы 69
5.2. Микроорганизмы и условия их культивирования 69
5.3. Получение препаратов зрелых спор 70
5.4. Определение ферментативных активностей 70
5.4.1. Определение бактериолитической активности 70
5.4.2. Определение дрожжелитической активности 71
5.4.3. Определение протеазной активности 71
5.4.4. Определение пептидазной активности 72
5.5. Определение количества белка 73
5.6. Получение лизоамидазы 73
5.7. Выделение и очистка компонентов лизоамидазы 73
5.7.1. Выделение пептидаз Лі и Л4 73
5.7.1.1. Осаждение белков сульфатом аммония 73
5.7.1.2. Ионообменная хроматография на СМ-сефадексе С-50 74
5.7.1.3. Ионообменная хроматография на SP-сефадексе С-50 74
5.7.1.4. Гельфильтрация на сефакриле S-200 74
5.7.1.5. Электрофоретический анализ ферментных препаратов 75
5.7.2. Выделение и очистка М-ацетил-мураноил-Ь-аланин амидазы Л2 и мурам идазы М 75
5.7.3. Выделение и очистка металлопротеазы лизоамидазы 76
5.7.4. Выделение и очистка полисахарида лизоамидазы 76
5.8. Реконструкция фермент-полисахаридного комплекса 76
5.9. Характеристика полученных ферментных препаратов 76 5.9.1. Вестерн-блоттинг 76
5.9.2. Идентификация N-концевых аминокислотных последовательностей молекул ферментов 77
5.9.3. Определение оптимального значения рН для действия нового бактериолитического фермента Л4 и металлопротеазы 77
5.9.4. Определение оптимального значения концентрации буфера для действия ферментов Л4
и металлопротеазы 77
5.9.5. Определение влияния температуры на проявление активности ферментов Л4 и металлопротеазы 78
5.9.6. Определение термостабильности ферментов Л4 и металлопротеазы 79
5.9.7. Определение действия ингибиторов на активность ферментов Л4 и металлопротеазы 79
5.9.8. Определение заряда фермента Л4 методом электрофореза 80
5.9.9. Определение молекулярных масс ферментов Л] и Л4 80
5.10. Изучение действия лизоамидазы и ее компонентов на эндоспоры бактерий рода Bacillus 81
5.10.1. Изучение действия лизоамидазы и лизоцима на зрелые споры бацилл с выявлением результатов на жидкой среде 81
5.10.2. Изучение действия лизоамидазы на зрелые споры бацилл с выявлением результатов
на твердой среде 81
5.10.3. Изучение действия лизоамидазы на зрелые споры бацилл с выявлением результатов нп жидкой среде с последующим высевом на твердую среду 82
5.10.4. Изучение действия гомогенных ферментов лизоамидазы, полисахарида лизоамидазы и
реконструированных фермент-полисахаридных комплексов на зрелые споры бацилл 83
5.10.5. Обработка спор В. subtilis W-23, В. subtilis 168 и Л. cereus 217 лизоамидазой для последующего исследования методом атомно-силовой микроскопии 83
ГЛАВА 6. Результаты исследования и их обсуждение 84
6.1. Изучение действия лизоамидазы на зрелые споры бактерий рода Bacillus 84
6.2. Исследование спор В. subtilis W-23, В. subtilis 168
и В. cereus 217, обработанных лизоамидазсй, методом атомно-силовой микроскопии 92
6.3. Изучение роли компонентов лизоамидазы в действии препарата на зрелые споры бактерий рода Bacillus 94
6.3.1. Выделение, очистка и характеристика компонентов лизоамидазы 95
6.3.1.1. Выделение пептидазы Лі и обнаружение ранее неизвестного бактериолитического фермента Л4 95
6.3.1.2. Изучение основных физико-химических свойств нового бактериолитического фермента Л4 100
6.3.1.3. Выделение и очистка М-ацетил-мурамоил-Ь-аланин амидазы Л2 и мурамидазы М 108
6.3.1.4. Выделение и очистка металлопротеазы лизоамидазы 108
6.3.1.5. Выделение и очистка экзополисахарида лизоамидазн и реконструирование фермент-полисахаридного комплекса 109
6,3.2. Изучение действия отдельных ферментов лизоамидазы,
полисахарида лизоамидазы и вариантов реконструкции препарата на зрелые споры
бактерий рода Bacillus 109
6.4, Обнаружение дрожжелитической активности металлопротеазы препарата лизоамидаза 115
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 119
ВЫВОДЫ 123
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 125
