Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Гены-супрессоры опухолевого роста, TSG 11
1.2. Современные подходы к поиску новых TSG 17
1.2.1. Анализ геми- и гомозиготных делеций. Количественная - ПЦР в режиме реального времени 18
1.2.2. Поиск участков хромосомы, обладающих способностью подавлять рост опухоли 21
1.2.3. "Вычитающая" гибридизация как один из альтернативных подходов к поиску TSG 22
1.2.4. Применение микропанелей для поиска генов супрессоров 24
1.2.5. Методы анализа метилирования промоторных районов генов-кандидатов на роль TSG в опухолях 26
1.3. Картирование на коротком плече хромосомы 3 критичных районов, потенциально содержащих гены, связанные с эпителиальными опухолями разных локализаций 30
1.3.1. Картирование критичных районов Зр в опухолях почки 30
1.3.2. Картирование критичных районов Зр в опухолях легкого. 32
1.3.3. Картирование критичных районов Зр в опухолях молочной железы 35
1.3.4. Картирование критичных районов Зр в опухолях женских репродуктивных органов 36
1.3.5. Критичные участки на Зр-плече, общие для эпителиальных опухолей разных локализаций 38
1.4. Роль метилирования в регулировании активности генов 42
1.4.1. CpG-островки и гены 42
1.4.2. Гипометилирование ДНК в опухолях 46
1.4.3. Гиперметилирование ДНК в опухолях 48
1.4.4. Эпигенетические механизмы инактивации генов 53
1.5. Гены-кандидаты на коротком плече хромосомы 3, активность которых подавляется в опухолях за счет метилирования 55
1.5.1. Новый ген-кандидат в области Зр23-р22.3 - RAR-beta 2 55
1.5.2. Область Зр21.3, район LUCA (lung cancer) 57
1.5.2.1. Ген-кандидат RASSF1A 59
1.5.2.2. Ген-кандидат SEMA3B. 60
2. Материалы и методы 62
2.1. Реактивы, ферменты и буферные растворы.. 62
2.2. Сбор материала 63
2.3. Выделение геномной ДНК из ткани 64
2.4. Анализ потерь гетерозиготносте 65
2.5. Полимеразная цепная реакция 68
2.6. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации 69
2.7. Метилчувствительный рестриктный анализ (МЧРА) 70
2.8. Бисульфитная модификация геномной ДНК 72
2.8.1 Бисульфитная конверсия ДНК в растворе 72
2.8.2. Бисульфитная конверсия ДНК в агарозных бусах 74
2.9. Метил-специфичная ПЦР (МСП) 74
2.10. Бисульфитное секвенирование 75
2.11. Статистическая обработка результатов 77
2.11.1. Точный критерий Фишера 77
2.11.2. Ранговая корреляции Спирмана 77
3. Результаты и обсуждение 79
3.1. Картирование критичных районов в области короткого плеча хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях пяти локализаций 79
3.1.1. Аллельные изменения в полиморфных маркерах Зр-плеча в ДНК эпителиальных опухолей 80
3.1.2. Аллельные изменения на Зр в образцах рака почки 84
3.1.3. Аллельные изменения на Зр в образцах рака легкого 86
3.1.4. Аллельные изменения на Зр в образцах рака молочной железы 88
3.1.5. Аллельные изменения на Зр в образцах рака яичников 90
3.1.6. Аллельные изменения на Зр в образцах рака шейки матки 92
3.1.7. Сравнение аллельных изменений на Зр в образцах ДНК эпителиальных опухолей пяти локализаций 94
3.1.8. Районы наиболее частых аллельных делеций в пяти типах эпителиального рака 96
3.1.9. Корреляция частоты аллельных делеций со степенью и стадией анаплазии в опухолях пяти локализаций 100
3.1.10. Подтверждение данных по картированию аллельных изменений на Зр-плече в опухолях RCC, ВС и СС с помощью ПЦР в режиме реального времени 103
3.1.11 Картирование гомозиготных делеций методом мультиплексной ПЦР 106
3.1.12. Скрининг гомозиготных делеций в генах из критичных районов Зр 109
3.1.13. Кластеры потенциальных TSG и онкогенов в критичных районах Зр 113
3.2. Спектр метилирования промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta2 в эпителивальных опухолях разной локализации 115
3.2.1. Анализ метилирования промоторного района гена RASSF1A методами МСП и МЧРА в опухолях почки, молочной железы и яичников 115
3.2.2. Анализ метилирования промоторного района гена SEMA3B в опухолях почки и яичников с применением МЧРА и бисульфитного секвенирования. 125
3.2.3. Анализ метилирования промоторного района гена RAR-beta2 в опухолях почки и яичников с применением МЧРА и бисульфитного секвенирования. 132
3.2.4. Корреляция уровня метилирования промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta2 со степенью анаплазии и с клинической стадией в опухолях различных локализаций 139
3.2.5. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров 141
Выводы 144
