Введение
Глава 1 Обзор литературы 15
1.1 Характеристика патогенных буркхольдерий 15
1.2 Лабораторная диагностика сапа и мелиоидоза 24
1.3 Использование ПЦР для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза 30
Собственные исследования 47
Глава 2 Материалы и методы 47
2.1 Объекты исследования 47
2.1.1 Штаммы микроорганизмов 47
2.1.2 Питательные среды и условия культивирования 53
2.2 Подготовка проб для ПЦР 54
2.2.1 Приготовление бактериальных взвесей 54
2.2.2 Подготовка проб биологического материала, объектов окружающей среды и продуктов питания, искусственно контаминированных возбудителями сапа и мелиоидоза 54
2.2.3 Подготовка проб крови, трахеобронхиального смыва и мокроты от больного с подозрением на мелиоидоз 56
2.3 Проведение лабораторных исследований биологического материала от животных с экспериментальной сапной и мелиоидозной инфекцией 56
2.3.1 Заражение лабораторных животных 56
2.3.2 Подготовка проб биологического материала от животных с экспериментальной сапной и мелиоидозной инфекциями 57
2.4 Обеззараживание проб для молекулярно-генетических исследований 58
2.5 Выделение ДНК 58
2.5.1 Выделение ДНК из бактериальных суспензий 58
2.5.2 Выделение ДНК из проб биологического материала и объектов окружающей среды 59
2.6 Постановка мультиплексной ПЦР-РВ 59
2.7 Учет продуктов амплификации 60
2.7.1 Гибридизационно-флуоресцентный учет результатов и расчет эффективности ПЦР 60
2.7.2 Проведение электрофореза 61
2.8 Секвенирование продуктов амплификации 62
2.9 Программы и базы данных 62
2.10 Статистическая обработка полученных данных 63
Глава 3 Разработка набора реагентов для дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени 64
3.1 Выбор, анализ ДНК-мишеней и конструирование праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для ПЦР-РВ 65
3.2 Оптимизация условий постановки мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени 73
3.3 Определение аналитической чувствительности и специфичности выбранных олигонуклеотидных затравок при исследовании культур микроорганизмов 76
Глава 4 Оценка диагностической эффективности сконструированной мультиплексной амплификационной тест-системы 82
4.1 Оценка эффективности разработанного набора реагентов для выявления патогенных буркхольдерий при экспериментальной инфекции 83
4.2 Исследование проб, искусственно контаминированных возбудителями сапа и мелиоидоза 89
4.3 Оценка функциональных характеристик созданного мультиплексного набора реагентов в рамках технических испытаний 94
4.4 Исследование клинического материала от больного с подозрением на мелиоидоз 99
Заключение 102
Выводы 109
Благодарности 110
Перечень сокращений, условных обозначений 111
Список использованных источников 112
