Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 20
Антигенсвязывающие фрагменты моноклональных антител 20
Отличительные особенности молекулярной структуры однодоменных антител23
Технология получения однодоменных антител 25
Продуценты однодоменных антител 33
Использование однодоменных антител для диагностики бактериальных инфекций 35
Использование однодоменных антител для терапии бактериальных инфекций 38
Представление о факторах вирулентности микоплазм 43
Патогенный потенциал Mycoplasma hominis 45
Лечение инфекций, вызванных Mycoplasma hominis, и поиск новых терапевтических мишеней 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 49
Материалы 49
Оборудование, использованное в диссертационной работе. 49
Микроорганизмы, используемые в диссертационной работе. 50
Линии клеток млекопитающих, использованные в диссертационной работе. 51
Плазмидные векторы, используемые в диссертационной работе. 52
Ферменты для молекулярно-биологических процедур . 52
Питательные среды и вещества. 53
Методы 53
Общелабораторные методы и подходы. 53
Культивирование микроорганизмов и культур клеток млекопитающих. 53
Выделение нуклеиновых кислот. 55
Молекулярное клонирование фрагментов ДНК. 55
Полимеразная цепная реакция. 56
Электрофоретическое разделение макромолекул. 58
Иммуноблоттинг. 58
Биотинилирование белков. 60
Определение нуклеотидной последовательности ДНК. 60
Получение однодоменных антител. 60
Выделение липид-ассоциированных мембранных белков (LAMPs) M. hominis. Иммунизация, отбор крови и выделение лимфоцитов. 61
Выделение РНК из лимфоцитов и синтез кДНК. 62
ПЦР-амплификация последовательностей VHH. 62
Клонирование VHH последовательностей в фагмидный вектор pHEN4 и получение библиотеки клонов-трансформантов . 63
Получение библиотеки бактериофагов. 64
Определение титра бактериофагов методом подсчета трансдуцирующих единиц. 65
Паннинг на антигене. 65
Скрининг клонов. 66
Получение рекомбинантных конструкций для экспрессии белков 69
Трансформация. 70
Продукция и очистка рекомбинантных белков. 72
Определение кинетических констант реакций. 74 Получение рекомбинантных аденовирусов. 74
Методы работы с животными 77
Статистическая обработка результатов исследований. 78
Биоинформатические методы. 79
ГЛАВА 3. Результаты 80
Получение и характеристика однодоменных антител, специфически связывающихся с M. hominis 80
Получение последовательностей, кодирующих однодоменные антитела. 80
Получение белкового препарата VHH. 88
Характеристика специфичности aMh06. 95
Тримеризация aMh06. 96
Создание продуцентов препаратов на основе aMh06 с изолейциновым зиппером (aMh06-ILZ-НА) 97
Определение термодинамических характеристик взаимодействия aMh06-ILZ с антигеном. 103
Идентификация антигена 105
Изучение диагностического потенциала препаратов на основе aMh06 для детекции M. hominis 107
Генетическая пассивная иммунизация для защиты от урогенитальной инфекции, вызванной M. hominis 113
Противомикоплазменное действие aMh в условиях in vitro. 113
Получение вектора для генетической пассивной иммунизации 114
Оценка эффективности подхода генетической пассивной иммунизации для
защиты от урогенитальной инфекции мышей, вызванной M. hominis 120
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 126
Выводы 142
Список литературы 143
