Введение
1. Влияние структуры шпилечных рибозимов на их каталитическую активность в реакциях расщепления и лигирования РНК 9
1.1 Строение и свойства шпилечных рибозимов 11
1.1.1 Минимальный шпилечный рибозим 11
1.1.1.1 Происхождение минимального шпилечного рибозима 11
1.1.1.2 Первичная, вторичная и третичная структура минимального шпилечного рибозима 13
1.1.1.3 Сворачивание рибозим-субстратного комплекса 19
1.1.1.4 Каталитический механизм действия шпилечных рибозимов 26
1.1.2 Обращенный шпилечный рибозим, его происхождение и свойства 31
1.2 Шпилечные рибозимы в реакциях расщепления и лигирования РНК 35
1.2.1 Природные рибозимы 36
1.2.1.1 Кинетика и термодинамика реакций расщепления и лигирования РНК 36
1.2.1.2 Влияние стабильности и структуры рибозим-субстратного комплекса на активность рибозима 41
1.2.2 Искусственные рибозимы 46
1.2.2.1 Вилочный шпилечный рибозим 46
1.2.2.2 Обращенный шпилечный рибозим 48
2. Дизайн и синтез двойного обращенного рибозима для сайт-иаправленного изменения последовательности РНК 53
2.1 Дизайн двойного рибозима как инструмента молекулярного воздействия 54
2.1.1 Стратегия сайт-направленного изменения последовательности РНК 54
2.1.2 Двойной рибозим R-DRBV 60
2.1.2.1 Предполагаемый способ синтеза рибозима R-DRBV 60
2.1.2.2 Синтез РНК посредством удлинения праймера при помощи РНК-полимеразы фага Т7 62
2.1.2.3 Разветвленный рибозим R-RB 67
2.1.2.3.1 Строение рибозима R-RB 67
2.1.2.3.2 Химический синтез рибозима R-RB 69
2.1.2.3.3 Каталитические свойства рибозима R-RB 75
2.2 Оптимизация структуры обычного обращенного рибозима в реакциях расщепления и лигирования РНК 81
2.2.1 Влияние природы нуклеотида в месте соединения доменов рибозима на его активность 81
2.2.2 Влияние длины полинуклеотидного линкера на активность рибозима 87
2.3 Двойной обращенный рибозим R-DRV в реакции сайт-направленного изменения последовательности РНК 90
2.3.1 Модельная реакция изменения последовательности субстрата S40F3F5 90
2.3.2 Синтез двойного рибозима R-DRV 94
2.3.3 Свойства рибозима R-DRV в реакции расщепления РНК 96
2.3.4 Изменение последовательности РНК при помощи рибозима R-DRV 103
2.3.5 Оптимизация условий реакции изменения последовательности РНК 105
2.3.6 Каталитическая активность рибозима R-DRV 109
2.3.7 Внутреннее мечение РНК остатком молекулы-красителя Су5 112
3. Экспериментальная часть 116
3.1 Реактивы и материалы 116
3.1.1 Реагенты и растворители 116
3.1.2 Ферменты 116
3.1.3 Буферные растворы 116
3.1.4 Разделяющие материалы 117
3.1.5 Приборы 117
2.2 Методы и методики 119
3.2.1 Физико-химические методы анализа 119
3.2.1.1 Анализ РНК при помощи A.L.F. секвенатора ДНК 119
3.2.1.2 Анализ РНК при помощи LiCor 4200 секвенатора ДНК 119
3.2.1.3 Методы при получении РНК и ДНК 120
3.2.2 Синтезы 121
3.2.2.1 Синтез амидофосфита 1Ч4-(6-гидроксигексил-0-левулинил)-5-метил-5-0-(4,4-ДИметокситрифенил-метил)-1 -p-D-2-дезоксицитидина (8) 121
3.2.2.2 Синтез субстратных РНК 127
3.2.2.3 Мечение субстратных РНК 129
3.2.2.4 Синтез разветвленного рибозима R-RB 130
3.2.2.5 Синтез немодифицированных рибозимов 131
3.2.2.6 Синтез РНК-фрагментов, содержащих 2,3-циклическую фосфатную группу 134
3.2.3 Определение нуклеотидного состава рибозима R-RB 135
3.2.4 Получение РНК посредством удлинения праймера при помощи РНК-полимеразы фага Т7 136
3.2.5 Расщепление РНК-субстратов 137
3.2.6 Лигирование РНК-фрагментов 139
3.2.7 Изменение последовательности РНК 140
3.2.8 УФ плавление дуплексов 141
3.2.9 Определение периода полураспада 2.3-циклической фосфатной группы в составе РНК 141
Выводы 143
