Список используемых сокращений 5
Введение 8
Глава 1. Обзор литературы. Разработка вакцин против COVID-19 14
1.1. Значимость заболеваний, вызванных коронавирусными инфекциями 14
1.2. Подходы к разработке вакцин против COVID-19 15
1.2.1. Вакцины на основе целых вирусов 16
1.2.1.1. Инактивированные вакцины 16
1.2.1.2. Живые вакцины 19
1.2.2. Субъединичные вакцины 20
1.2.3. Векторные вакцины 25
1.2.3.1. Нереплицирующиеся векторные вакцины 26
1.2.3.2. Самореплицирующиеся вакцины 29
1.2.4. Нуклеиновые кислоты в качестве вакцин 30
1.2.4.1. мРНК-вакцины 31
1.2.4.2. ДНК-вакцины 34
1.3. Выводы по обзору литературы 41
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Материалы 42
2.1.1. Олигонуклеотиды 42
2.1.2. Синтетические пептиды 42
2.1.3. Коммерческие наборы, ферменты, реактивы 44
2.1.4. Клеточные линии, штаммы бактерий и вирусов, плазмиды 47
2.1.5. Питательные среды 48
2.1.6. Растворы и буферы 49
2.2. Методы 51
2.2.1. Проектирование генов 51
2.2.2. Конструирование рекомбинантных плазмид 51
2.2.3. Трансформация E. coli Stbl3 плазмидными ДНК 52
2.2.4. Наработка препаративного количества рекомбинантных плазмид 52
3
2.2.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК 53
2.2.6. Спектрофотометрический и рестрикционный анализ ДНК в
агарозном геле 53
2.2.7. Магнитная трансфекция эукариотических клеток HEK293T целевыми
плазмидами 53
2.2.8. Выделение тотальной РНК из клеток HEK293T, трансфицированных
целевыми плазмидами 54
2.2.9. Постановка реакции ОТ-ПЦР 54
2.2.10. Выявление целевых белков с помощью иммуноблотинга 55
2.2.11. Наработка белков S и RBD 55
2.2.12. Синтез полимерного конъюгата, состоящего из полиглюкина и
спермидина 56
2.2.13. Конъюгация полиглюкин-спермидина с белком RBD (PGS-RBD) 57
2.2.14. Получение комплексов PGS и PGS-RBD с плазмидной ДНК 57
2.2.15. Исследование размеров полученных комплексов 57
2.2.16. Измерение кинетики связывания белка RBD в составе комплекса с
помощью биослойной интерферометрии 58
2.2.17. Иммунизация лабораторных животных 58
2.2.18. Подготовка образцов крови и селезёнок для анализа 59
2.2.19. Иммуноферментный анализ 59
2.2.20. Тест вируснейтрализации 60
2.2.21. Исследование Т-клеточного ответа 60
2.2.21.1. методом ELISpot 60
2.2.21.2. методом ICS 61
2.2.22. Исследование протективного ответа на модели лабораторных
животных 62
2.2.23. Графическая и статистическая обработка результатов 62
Глава 3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Комбинированная ДНК-белковая вакцина 64
3.1.1. Конструирование ДНК-вакцины pVAXrbd 64
4
3.1.2. Оценка экспрессии целевого гена in vitro 65
3.1.3. Получение комплексов ДНК с полимерными конъюгатами и изучение
их характеристик 66
3.1.3.1. Выбор и синтез полимерных конъюгатов 67
3.1.3.2. Сборка частиц 68
3.1.3.3. Измерение кинетики связывания RBD свободного и в составе
частиц 70
3.1.4. Исследование иммуногенности полученных препаратов 71
3.1.4.1. Гуморальный иммунный ответ 72
3.1.4.2. Клеточный иммунный ответ 74
3.1.4.3. Оценка протективности 76
3.2. Искусственный Т-клеточный иммуноген 77
3.2.1. Дизайн pBSI-COV-Ub, кодирующей искусственный
полиэпитопный иммуноген, содержащий эпитопы различных белков
вируса SARS-CoV-2 77
3.2.2. Исследование экспрессии целевых генов 86
3.2.3. Исследование иммуногенности ДНК-вакцин, кодирующих
искусственную полиэпитопную конструкцию 88
3.2.3.1. Клеточный иммунный ответ 88
3.2.3.2. Исследование протективности 90
3.2.4. Исследование иммуногенности комбинированной конструкции,
содержащей ДНК-вакцину pBSI-COV-Ub и рекомбинантный белок RBD,
конъюгированный с полиглюкин-спермидином 92
3.2.4.1. Гуморальный иммунный ответ 92
3.2.4.2. Клеточный иммунный ответ 93
3.3. Заключение 95
Выводы 97
Список литературы 98
