Введение
2. Литературный обзор 15
2.1. Структура и механизм катализа цитохрома р450 (cyp450) и его роль в детоксикации ксенобиотиков 15
2.1.1. Реакции, катализируемые цитохромом Р450 16
1.1.1. Механизм катализа цитохромом Р450 18
1.1.2. Многообразие и субстратная специфичность изоферментов Р450 21
2.2. Сравнительная характеристика гепатоцитов и клеточных линий для использования в «печени-на-чипе» 23
2.2.1. Первичные гепатоциты 24
2.2.2. Upcyte гепатоциты 25
2.2.3. Линия HepG2 26
2.2.4. Линия HepaRG 26
2.2.5. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) 27
2.3. Микробиореактор гомункулус разработка и оптимизация 31
2.4. Новые направления в разработке лекарственных препаратов 35
2.4.1. Регуляция HIF - фактора, индуцируемого гипоксией 37
2.4.2. Поиск возможных ингибиторов HIF пролилгидроксилазы 39
3. Экспериментальная часть 43
3.1. Материалы 43
3.2. Методы
3.2.1. Пептидные и белковые субстраты: 43
3.2.2. Клонирование изоформ HIF пролилгидроксилазы 44
3.2.3 Экспрессия в E.coli, выделение растворимого фермента и рефолдинг из телец включения 45
3.2.4. Измерение каталитической активности 47
3.2.5. Ингибирование фермента препаратами оксихинолинов 48
3.2.6. Изучение стабильности при хранении 48
3.2.7. Культивирование HepaRG в МБР «Гомункулус» 48
3.2.8. Масс-спектрометрическое детектирование субстратов и их метаболитов 49
-5 3.2.9. ВЭЖХ субстратной смеси 50
3.2.10. Расчет пределов обнаружения и определения 50
3.2.11. Апробация панели субстрат-ингибитор 51
3.2.12. Исследование гепатотоксичности 52
4. Результаты и обсуждение 54
4.1. Разработка метода рефолдинга hif пролилгидроксилазы человека из телец включения e.coli. 54
4.1.1. Сравнение уровней экспрессии различных изоформ PHD в клетках Е. coli 54
4.1.2. Выделение растворимой формы PHD2 и метод непрерывной регистрации активности 55
4.1.3. Рефолдинг PHD2 из телец включения E.coli и очистка: 57
4.1.4. Изучение ингибирования препарата фермента
PHD2 оксихинолинами 60
4.2. Оптимизация и валидация панели субстрат-ингибитор 62
4.2.1. Выбор субстратов и ингибиторов 63
4.2.2. Разработка и оптимизация метода детектирования метаболитов 76
4.2.3. Раздельное определение метаболитов панели методом ВЭЖХ 85
4.2.4. Апробация панели 87
4.2.5. Валидация панели с помощью варфарина и дазатиниба 90
4.3. Доклиническая оценка гепатотоксичности кандидатов-антгипоксантов 101
4.3.1. Гепатотоксичность на дифференцированной линии HepaRG 101
4.3.2. Идентификация изоформ Р450, участвующих в окислении исследуемых соединений
5. Заключение и выводы 112
6. Список литературы 115
