Введение
Обзор литературы 12
1. Парвовирусная инфекция свиней (ПВИС) 12
1.1 Клинические признаки 12
1.2 Пути передачи 13
1.3 Патогенез 13
1.4 Характеристика возбудителя 14
Классификация 14
Морфология и геном вируса 14
Устойчивость 16
Антигенная вариабельность 16
Патогенность 17
1.5 Диагностика ПВИС 17
2. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) 21
2.1 Клинические признаки 21
2.2 Пути передачи 23
2.3 Патогенез 24
2.4 Характеристика возбудителя 26
Классификация 26
Морфология и химический состав 26
Устойчивость 26
Организация генома РРСС 27
Генетическая вариабельность вируса РРСС 28
2.5 Диагностика РРСС 29
3. Заключение по обзору литературы 33
Собственные исследования 34
Материалы и методы исследований 34
4.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе 34
4.2. Биологический материал, использованный в работе 36
4.3. Проведение ПЦР-анализа 37
4.3.1. Экстракция НК методом осаждения изопропанолом 37
4.3.2. Экстракция НК наборами Qiagen 40
4.3.3. Проведение ПЦР (ПВС) и ОТ-ПЦР (вирус РРСС) 41
4.4. Клонирование ДНК и кДНК в плазмиду pGEM 44
4.5. Клонирование ДНК в фаг AgtlO 44
4.6. Очистка продуктов ПЦР 44
4.7. Секвенирование 45
4.8. Проведение филогенетического анализа 46
Результаты исследований 46
5. Разработка тест-системы для выявления ДНК парвовируса свиней 46
5.1. Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции ДНК ПВС 46
5.2. Анализ специфичности работы олигонуклеотидов 47
5.3. Подбор оптимальных условий амплификации 48
5.4. Введение контрольных образцов 49
5.5. Анализ чувствительности тест-системы 50
6. Разработка тест-системы для выявления и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней 52
6.1. Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции РНК вируса РРСС 52
6.2. Анализ специфичности работы олигонуклеотидов 53
6.3. Подбор оптимальных условий амплификации 53
6.4. Введение контрольных образцов 56
6.5. Анализ чувствительности тест-системы 56
7. Выбор метода экстракции нуклеиновых кислот 57
7.1. Подбор условий экстракции НК из спермы с использованием метода осаждения изопропанолом 57
7.2. Использование наборов Qiagen 58
8. Исследование вакцин против РРСС 60
9. Исследование биологического материала от свиней 60
9.1. Обнаружение образцов, содержащих ДНК ПВС 60
9.2. Обнаружение образцов, содержащих РНК вируса РРСС 62
9.3. Расследование вспышек, вызванных вирусом РРСС 64
9.4. Секвенирование образцов, содержащих РНК вируса РРСС 65
9.5. Филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ в2009-2013гг 65
9.6. Анализ биологического материала на наличие смешанных инфекций 68
10. Проведение комиссионных испытаний 69
11. Сравненительный анализ чувствительности и специфичности наборов для выявления ДНК ПВС 72
11.1. Сравнение с набором реагентов № 1 (производство Россия) 72
11.2. Сравнение с набором реагентов №2 (производство Россия) 73
12. Сравненительный анализ чувствительности и специфичности наборов для выявления РНК вируса РРСС 76
12.1. Сравнение с наборами реагентов №1 и №2 (производство Россия) 76
12.2. Сравнение с набором реагентов №3 (производство Россия) 79
12.3. Сравнение с набором реагентов №4 (производство Франция) 83
Обсуждение собственых исследований 84
Выводы 90
Практические предложения 91
Список использованной литературы 92
