Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Физиолого-биохимические особенности метаболизма фототрофных пурпурных бактерий 14
1.1.1. Галоалкалофильные прокариоты Rhodоvulum steppense А-20sT и их характеристика 15
1.1.2. Метаболизм пурпурных бактерий 18
1.2. Характеристика малатдегидрогеназной ферментной системы 22
1.2.1. Метаболические пути, в которых участвует малатдегидрогеназа22
1.2.2. Cтруктурная организация малатдегидрогеназы 25
1.2.3. Типы пространственной организации малатдегидрогеназы 30
1.3. Роль малатдегидрогеназы в адаптации клеточного метаболизма галофильных прокариот и системы защиты от стрессовых факторов 34
1.3.1.Адаптационные структуры геномов и протеомов галофильных микроорганизмов 34
1.3.2. Сравнительное исследование сольвационной оболочки МДГ и ее роль в галоадаптации прокариот 35
1.3.3. Анализ специфики вторичной белковой структуры галофильных МДГ 40
1.3.4. Кислород как фактор стресса и его роль в метаболизме аэротолерантных и анаэробных микроорганизмов 42
1.4. Молекулярно-биологические аспекты функционирования малатдегидрогеназного комплекса у бактерий 47
1.4.1. Молекулярные формы МДГ и их генетическая детерминация 47
1.4.2. Клонирование, секвенирование и экспрессия генов mdh бактериальных организмов 50
Глава 2. Экспериментальная часть 55
2.1. Объекты и методы исследования 55
2.1.1. Объект исследования 56
2.1.2. Методы исследования 55
2.1.2.1. Питательные среды для культивирования бактерий 55
2.1.2.2. Детекция ферментативной активности 56
2.1.2.3. Измерение количественного содержания белка в исследуемых образцах 58
2.1.2.4. Модифицированная схема ферментативной очистки 59
2.1.2.5. Электрофоретические методы анализа 60
2.1.2.5.1. Исследование электрофоретической подвижности в нативном ПААГ 60
2.1.2.5.2. Анализ гомогенности энзиматических образцов 60
2.1.2.5.3. Метод специфического проявления ферментов 61
2.1.2.5.4. Электрофоретический анализ в присутствии додецилсульфата натрия 61
2.1.2.6. Детекция молекулярной массы изоформ энзима 62
2.1.2.7. Масс-спектрометрический анализ МДГ 62
2.1.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов 63
2.1.3. Молекулярные исследования 63
2.1.3.1. Выделение геномной ДНК и суммарной клеточной РНК 63
2.1.3.3. Расчет концентрации РНК в пробе 63
2.1.3.3. Метод обратной транскрипции 64
2.1.3.4. Электрофорез нуклеиновых кислот 64
2.1.3.5. Подбор вырожденных и специфических праймеров 64
2.1.3.6. Проведение полимеразной цепной реакции 65
2.1.3.7. Секвенирование ПЦР-продукта 66
2.1.3.8. Проведение ПЦР-РВ 67
2.1.4. Методы вариационной статистики в процессе обработки данных 67
2.2. Полученные результаты и их обсуждение 68
2.2.1. Индукция новых изоформ МДГ у бактерий Rh. steppense при хемотрофном типе культивирования в аэробных условиях 68
2.2.2. Получение электрофоретически гомогенных препаратов изоформ МДГ 69
2.2.2.1. Многостадийная схема очистки исследуемого энзима 69
2.2.2.2. Анализ гомогенности энзиматических препаратов МДГ 71
2.2.2.3. Значения молекулярной массы исследуемых изоформ фермента 71
2.2.2.4. Анализ субъединичного строения молекулярных форм МДГ 71
2.2.3. Идентификация пептидов МДГ методом масс-спектрометрии 76
2.2.4. Некоторые кинетические характеристики и регуляция активности изоформ МДГ 78
2.2.4.1. Исследование влияния различных концентраций H+– ионов на энзиматическую активность 78
2.2.4.2. Расчет значений величин констант Михаэлиса-Ментен 78
2.2.4.3. Расчет величин констант субстратного ингибирования для изоформ МДГ 84
2.2.4.4. Действие различных концентраций катионов металлов на каталитическую активность МДГ 86
2.2.4.5. Анализ влияния ряда интермедиатов ЦТК на каталитическую активность изоформ энзима 88
2.2.4.6. Определение температурного оптимума для изоформ МДГ 94
2.2.4.7. Исследование и анализ термостабильности малатдегидрогеназы 96
2.2.5. Функционирование МДГ из Rh. steppense при индукции глиоксилатного цикла 98
2.2.5.1. Индукция активности изоцитратлиазы при хемотрофном типе культивирования бактерий 99
2.2.5.2. Динамика активности изоцитратлиазы 99
2.2.6. Функционирование МДГ из Rh. steppense в условиях оксидативного стресса 102
2.2.7. Молекулярно-биологические исследования 105
2.2.7.1. Выделение ДНК и экстракция суммарной клеточной РНК 105
2.2.7.2. Идентификация гена mdh у бактерий Rh. steppense 105
2.2.7.3. Амплификация комплиментарной ДНК 107
2.2.7.4. Выявление особенностей экспрессии mdh из Rh. steppense в зависимости от условий культивирования 109
2.2.7.5. Исследование динамики появления индуцибельных изоформ МДГ из Rh. steppense 111
Заключение 115
Выводы 119
Список использованной литературы 121
