Введение
1. Литературный обзор 10
1.1 Общая характеристика рода Bacteroides 10
1.2 Структура и функции везикул грамотрицательных бактерий 15
1.3 Факторы вирулентности и токсины, ассоциированные с везикулами 17
1.4 Особенности везикулярного трафика у B.fragilis 23
1.5 Регуляция иммунного ответа посредством везикул B.fragilis 25
1.6 B.fragilis – оппортунистический патоген 27
1.7 Протеолитическая активность фрагилизина 29
1.8 Заключение 31
2. Материалы и методы 32
2.1 Бактериальные штаммы и клеточные культуры 32
2.2 Антитела 32
2.3 Химические реагенты 33
2.4 Выделение везикул 34
2.5 Электронная микроскопия препарата везикул и клеток 34
2.6 Фракционирование клеточного лизата 34
2.7 Геномное сравнение штаммов 35
2.8 Выделение белка и электрофорез 36
2.9 Протеомное исследование везикул методом ВЭЖХ-МС/МС
2.9.1 Пробоподготовка 36
2.9.2 Параметры измерения для протеомного анализа везикул 37
2.9.3 Идентификация белков и пептидов
2.10 Протеогеномный анализ 38
2.11 Метаболомный анализ с использованием ВЭЖХ-МС/МС метода
2.11.1 Пробоподготовка 38
2.11.2 Параметры детекции метаболитов методом ВЭЖХ-МС/МС 39
2.11.3 Интерпретация результатов 40
2.11.4 Статистическая обработка результатов метаболомного анализа 40
2.12 Метаболомика ГХ-МС 41
2.12.1 Пробоподготовка 41
2.12.2 Параметры детекции метаболитов методом ВЭЖХ-МС/МС 41
2.12.3 Интерпретация результатов
2.13 Реконструкция метаболических карт везикул 42
2.14 Анализ активности биохимических реакций с применением изотопно-меченого метаболита 42
2.15 Определение локализации токсина
2.15.1 Вестерн-блот гибридизация 43
2.15.2 Электронная микроскопия с применением антител против токсина, меченых золотом 43
2.16 Липидомное исследование мембраны и ЛПС 44
2.16.1 Липидная экстракция 44
2.16.2 Исследование компонентов мембраны методом прямого ввода образца
2.17 Компьютерное моделирование взаимодействия токсина со структурами везикул 45
2.18 Физико-химические методы для оценки природы ассоциации токсина и структур везикулы 46
2.19 Биологические методы для оценки природы взаимодействия токсина и везикулы
2.19.1 Флюоресцентная микроскопия 48
2.19.2 Эксперименты по протеолитическому расщеплению E-кадгерина посредством везикул 48
2.19.3 Эксперименты по протеолитическому расщеплению E-кадгерина с примененим модели искусственных липосом 49
2.19.4 Геммаглютинация 50
3 Результаты и обсуждение 51
3.1 Выбор оптимальной фазы роста бактерий для выделения везикул 51
3.2 Электронная микроскопия бактериальных срезов и препаратов везикул 52
3.3 Генетический анализ исследуемых бактериальных штаммов 54
3.4 Сравнительное протеомное исследование везикул 56
3.4.1 Структурные белки и их сублокализации 57
3.4.2 Ферменты и метаболические пути 63
3.4.3 Факторы патогенности и вирулентности
3.5 Идентификация токсина методами вестерн блота и электронной микроскопии с применением антител против токсина, меченых золотом 71
3.6 Липидомное исследование 76
3.7 Компьютерное моделирование процессов взаимодействия токсина со структурами мембраны везикулы 81
3.8 Физико-химические методы для подтверждения результатов компьютерного моделирования 3.8.1 Флюоресцентное тушение 89
3.8.2 ЯМР 91
3.9 Биологические эксперименты для определения локализации токсина и его протеолитической активности 93
3.9.1 Времязависимая протеолитическая деградация E-кадгерина 93
3.9.2 Опосредованная локализацией токсина деградация E-кадгерина 95
3.9.3 Флюоресцентная микроскопия препарата везикул и токсин-содержащих липосом 96
3.9.4 Тест на геммаглютинацию
3.10 Сравнительное метаболомное исследование везикул 99
3.11 Реконструкция метаболических реакций, протекающих в обоих штаммах 104
3.12 Метаболомное исследование с применением изотопно-меченого метаболита 110
4. Заключение 112
5. Выводы 114
6. Список сокращений 115
7. Список литературы 117
