Введение
Обзор литературы 10
1 Проблема недорепликации ДНК на физических концах хромосом 10
2 Теломерная и свободнорадикальная теории старения 11
3 Теломеры: структура и функции 16
3.1 Нуклеотидная последовательность и структура теломер 16
3.2 Длина теломер 19
3.3 Белки, связанные с теломерами 23
3.3.1 Теломераза 23
3.3.2 Белок POT1, связывающийся с одноцепочечной теломерной ДНК 24
3.3.3 Белок TRF2, связывающийся с двуцепочечной теломерной ДНК 4 A. thaliana как модельное растение для изучения длины теломер 30
5 Факторы, влияющие на установление и поддержание видоспецифичной длины теломер 35
5.1 Регуляция длины теломер с помощью биохимической активности теломер-связывающих белков 35
5.2 Регуляция длины теломер с помощью факторов окружающей среды, окислительного стресса и стиля жизни 36
5.3 Регуляция длины теломер между популяциями одного вида за счет генетических факторов 37
6. Рекомбинантные инбредные линии с множественными родительскими экотипами 39
Экспериментальная часть 48
Материалы и методы 48
1 Экотипы растений A. thaliana, условия их роста 48
2 Клонирование генов POT1 из A. cepa и TRFL1 из A. officinalis 49
3 Трансформация клеток E. coli 50
4 Экспрессия белка 50 5 Электрофорез в полиакриламидном геле 51
6 Вестерн блот 52
7 Очистка белка 53
8 Изучение ДНК-связывающей активности белков POT1 и TRFL1 c одноцепочечными и двухцепочечными теломерными ДНК-субстратами 53
9 Анализ влияния абиотических факторов среды на изменение длины теломер 55
9.1 Изучение влияния засухи на длину теломер в растениях 55
9.2 Изучение влияния недостатка фосфора на длину теломер в растениях 10 Выделение геномной ДНК растений 56
11 Электрофорез ДНК 57
12 Анализ длины теломер методом рестрикции концевых фрагментов хромосом (TRF) 60
12.1 Нерадиоактивный метод визуализации теломерного сигнала 60
12.2 Радиоактивный метод визуализации теломерного сигнала 61
13 Анализ длины теломер с помощью амплификации теломерных повторов ПЦР-методом PETRA 61
14 Биоинформатический метод обработки данных, полученных при помощи метода рестрикции концевых участков хромосом 63
15 Картирование локусов количественных признаков, отвечающих за контроль длины теломер 64
16 Метод анализа генов-кандидатов 64
17 Генотипирование 65
18 Полимеразная цепная реакция 67
19 Скрещивание растений и получение двойных мутантов 67
20 Анализ изменения длины теломер в разных поколениях мутантных растений 68
21 Статистическая обработка данных 68
Результаты 69
1 Изучение биохимических свойств и субстратной специфичности белка POT1 из лука 69
2 Изучение биохимических свойств и субстратной специфичности белка TRFL1 из спаржи (A. officinalis) 80
3 Анализ внутривидового полиморфизма длины теломер A. thaliana 85
3.1 Сравнительный анализ длины теломер 19 родительских экотипов рекомбинантных инбредных линий MAGIC 85
3.2 Вариабельность длины теломер у различных растений одного экотипа 86
4 Влияние факторов роста на длину теломер растений A. thaliana 88
4.1 Влияние засухи на длину теломер A. thaliana 89
4.2 Влияние различных источников фосфора на длину теломер 90
5 Картирование в рекомбинантных инбредных линиях MAGIC локусов количественных признаков, влияющих на длину теломер 95
6 Биоинформатический анализ, выбор генов-кандидатов 100
7 Генотипирование Т-ДНК мутантов для идентификации гомозиготных растений 103
8 Анализ длины теломер в мутантных растениях 105
9 Дополнительное подтверждение укорочения длины теломер в мутантах по гену nop2a 109
10 Анализ изменения длины теломер в разных поколениях мутантных растений по гену nop2a 112
Обсуждение результатов 114
1 Биохимическая активность теломер-связывающих белков POT1 и TRF1 114
2 Факторы окружающей среды и условия роста 118
3 Идентификация нового генетического фактора, влияющего на внутривидовую вариацию в длине теломер 120
Заключение 126
Список литературы 128
