Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Редокс-зависимые процессы в клетке 11
1.2. Роль глутатиона в клеточных редокс-зависимых процессах 11
1.2.1. Синтез de novo и ресинтез глутатиона 11
1.2.2. Роль соотношения восстановленного и окисленного глутатиона в клеточных редокс-зависимых процессах 14
1.2.3. Глутатион и редокс-зависимая регуляция апоптоза 19
1.3. Роль глутатионтрансферазы в редокс-зависимых процессах 25
1.4. Глутаредоксин. Роль в редокс-зависимой регуляции 32
1.5. Мультилекарственная устойчивость опухолевых клеток. Механизмы формирования 38
1.6. Противоопухолевое действие цисплатина. Роль алкилирования ДНК и генерации активных форм кислорода 47
Глава 2. Материалы и методы 63
2.1. Культуры клеток. Условия культивирования 63
2.2. Оценка жизнеспособности клеток 63
2.3. Схема лизирования клеток 64
2.4. Определение содержания общего (GSН + GSSG) и окисленного (GSSG) глутатиона 64
2.5. Определение содержания белка методом Бредфорда 65
2.6. Определение активности -глутамилцистеинсинтетазы 65
2.7. Определение активности -глутамилтрансферазы 66
2.8. Определение активности глутатионредуктазы 66
2.9. Определение активности глутатионтрансферазы 66
2.10. Определение активности глутаредоксина 66
2.11. Оценка экспрессии генов с помощью метода ОТ-ПЦР 67
2.12. Определение уровня белков методом Вестерн-блоттинга 68
2.13. Оценка апоптоза методом проточной цитофлуориметрии с помощью окрашивания клеток пропидий иодидом и аннексином V, конъюгированным флуорохромом FITC 69
2.14. Определение уровня продукции супероксид-анион радикала (О ) 71
2.15. Методы статистического анализа 71
Глава 3. Результаты исследований 72
3.1. Экспрессия генов, контролирующих синтез GSH de novo и восстановление его окисленной формы, при формировании резистентности опухолевых клеток к цисплатину 72
3.1.1. Оценка содержания восстановленного и окисленного глутатиона в опухолевых клетках, чувствительных и резистентных к цисплатину. Анализ изменения отношения GSH к GSSG как основного показателя в формировании окислительно-восстановительного статуса клетки 72
3.1.2. Оценка экспрессии генов -глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтетазы – ключевых ферментов синтеза GSH de novo в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 73
3.1.3. Оценка экспрессии гена и активности -глутамилтрансферазы в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 76
3.1.4. Оценка экспрессии гена и активности глутатионредуктазы в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 78
3.2. Оценка экспрессии генов и активности изоформ GSTP1-1, GSTA4-4, GSTT1-1, GSTM1-1 и GSTK1-1 в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 80
3.3. Оценка экспрессии генов изоформ Grx1 и Grx2 и активности глутаредоксина в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 85
3.4. Оценка транскрипционного фактора Nrf2 в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 87
3.5. Оценка активности глутатионтрансферазы и глутаредоксина, соотношений GSH/GSSG, Bcl-2/Bax и Bcl-xl/Bax, уровня активных форм кислорода у чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клеток при активации апоптоза действием перекиси водорода 89
3.6. Оценка активности глутатионтрансферазы и глутаредоксина, соотношений GSH/GSSG, Bcl-2/Bax и Bcl-xl/Bax, уровня активных форм кислорода у чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клеток при активации апоптоза действием цисплатина 98
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 108
Заключение 117
Выводы 119
Список использованной литературы 120
Благодарности 155
