Введение
2 Обзор литературы 5
2.1 Взаимодействия полярных аминокислот в белках 6
2.1.1 Причины, приводящие к изменениям pKa боковых групп аминокислот 6
2.1.2 Заряд-зарядовые взаимодействия 7
2.1.3 Заряд-дипольные взаимодействия 7
2.1.4 Эффекты десольватирования 9
2.1.5 Погружение заряженных аминокислот в белковую глобулу 10
2.1.6 Возможность ионизации остатка триптофана в нативных белках 13
2.2 Флуоресцентные белки 15
2.2.1 Пространственная структура флуоресцентных белков 16
2.2.2 Вторичные структуры и топология бочонка 16
2.2.3 Фолдинг флуоресцентного белка 17
2.2.4 Формирование хромофора 18
2.2.5 Аминокислоты, катализирующие формирование хромофора 19
2.2.6 Структуры хромофоров природных флуоресцентных белков 20
2.2.7 Хромофоры флуоресцентных белков, полученных в биотехнологии 22
2.2.8 Влияние аминокислотного окружения на спектральные свойства флуоресцентного белка 23
3 Материалыиметоды исследования 26
3.0.9 Амплификация ДНК и анализ продуктов амплификации 26
3.0.10 Создание библиотек случайных мутантов для направленной эволюции 26
3.0.11 Направленный мутагенез кодирующей последовательности белков
3.0.12 Электрическая трансформация клеток E. coli (электропорация) 31
3.0.13 Химическая трансформация клеток Е.coli 32
3.0.14 Выделение плазмидной ДНК 32
3.0.15 Секвенирование плазмидной ДНК 33
3.0.16 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 33
3.0.17 Измерение спектров поглощения и флуоресценции 33
3.0.18 pH-титрование 34
3.0.19 Титрование мочевиной 34
3.0.20 Компьютерное моделирование 34
3.0.21 Временная экспрессия в эукариотических клетках 34
3.0.22 Флуоресцентная микроскопия 35
3.0.23 Обработка данных 35
4 Результатыиобсуждение 36
4.1 Ионизация хромофора на основе триптофана в нативном белке 37
4.1.1 Выбор модельного белка для проведения мутагенеза 37
4.1.2 Выбор позиций для мутагенеза 39
4.1.3 Получение мутантов mCerulean методом направленного мутагенеза 39
4.1.4 Случайный мутагенез белка mCerulean V61K 40
4.1.5 Случайный мутагенез белка mCerulean V61K D148G Y151N 41
4.1.6 Спектральные характеристики WasCFP 41
4.1.7 Зависимость спектров поглощения WasCFP от температуры 46
4.1.8 Зависимость спектров поглощения WasCFP от pH 46
4.1.9 Зависимость спектров флуоресценции от pH 46
4.1.10 Зависимость спектров поглощения WasCFP от концентрации мочевины 49
4.2 Интерпретация спектральных свойств WasCFP 50
4.2.1 Являются ли пики на 495 нм и 458 нм пиками поглощения одной формы белка? 50
4.2.2 Что происходит с белком при значениях pH ниже 6? 50
4.2.3 Почему положения изобестических точек для температурной и pH-зависимостей спектров поглощения отличаются? 50
4.2.4 Почему увеличивается оптическая плотность в области поглощения длинноволновой формы при увеличении концентрации мочевины? 4.2.5 Почему длинноволновая форма белка исчезает при высоких pH (pK = 10.5)? 51
4.2.6 Чем объясняется зависимость спектров поглощения от pH? 51
4.2.7 Чем объясняется зависимость спектров поглощения от температуры? 51
4.2.8 Соответствует ли длинноволновый пик поглощения молекулам белка с ионизованным хромофором? 51
4.2.9 Предполагаемые структурные основы наблюдаемых явлений 53
4.3 WasCFP в качестве метки для флуоресцентной микроскопии 55
4.4 Получение белка со стабильной анионной формой хромофора 57
4.4.1 Направленная эволюция WasCFP с отбором на яркость и стабильность анионной формы 57
4.4.2 Спектральные характеристики NowGFP 57
4.4.3 Фотопереключения NowGFP 59
4.5 Кристаллографическое исследование NowGFP 61
4.6 NowGFP в качестве метки для флуоресцентной микроскопии 62
4.7 NowGFP в качестве метки для микроскопии времени жизни флуоресценции 66
4.8 NowGFP в качестве донора при ферстеровском резонансном переносе энергии 68
5 Заключение 70
6 Выводы 71
7 Сокращения, научный жаргон и переводные термины 72
