Введение
2 Общая характеристика работы
2.1 Актуальность исследования 10
2.2 Цели и задачи исследования 12
2.3 Научная новизна и практическая ценность работы 13
2.4 Положения, выносимые на защиту 15
2.5 Апробация работы 16
2.6 Вклад автора 18
2.7 Структура и объем диссертации 19
2.8 Благодарности 19
3 Обзор литературы 21
3.1 Методы генетической инженерии в получении рекомбинантных белков, предназначенных для создания новых иммунобиологических препаратов
3.1.1 Краткая характеристика генетической инженерии. Исторический экскурс
3.1.2 Экспрессионные системы 22
3.1.3 Методы получения целевых генов для их клонирования и экспрессии, конструирование рекомбинантных ДНК
3.1.4 Методы введения молекул рекомбинантных ДНК в клетки
3.1.5 Лабораторные штаммы Е. coli, используемые в генетической инженерии
3.1.6 Клонирующие векторные плазмиды 49
3.1.7 Особенности экспрессионных векторных плазмид
3.2 Перспективы вакцинологии - применение ДНК-вакцин
3.2.1 Основные принципы конструирования ДНК-вакцин и механизм их действия
3.2.2 Проблемы создания эффективных вакцин против ВИЧ/СПИД
3.2.3 Конструирование искусственных ген-эквивалентов, кодирующих полиэпитопные ВИЧ-иммуногены, как основа создания эффективных ДНК-вакцин
3.2.4 Методы оптимизации полиэпитопных иммуно генов с целью повышения стимуляции CTL
3.2.5 Современные достижения в области разработки и 105 применения ДНК-вакцин
4 Материалы и методы исследования 108
4.1 Материалы 108
4.1.1 Реактивы 108
4.1.2 Наборы реактивов 109
4.1.3 Ферменты 109
4.1.4 Антибиотики 110
4.1.5 Олигодезоксирибонуклеотиды ПО
4.1.6 Буферные растворы 110
4.1.7 Растворы для трансформации клеток Е. coli 111
4.1.8 Растворы для выделения плазмидной ДНК 111
4.1.9 Растворы для гибридизации ДНК на нитроце ллю лозных фильтрах
4.1.10 Питательные среды 112
4.1.11 Плазмиды и векторы 113
4.1.12 Бактериальные штаммы 114
4.2 Методы 115
4.2.1 Общие методы исследования 115
4.2.1.1 Приготовление компетентных клеток Е. coli 115
4.2.1.2 Трансформация компетентных клеток Е. coli 115
4.2.1.3 Выделение плазмидной ДНК 116
4.2.1.4 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 117
4.2.1.5 Введение радиоактивной метки 32Р по «липким» концам молекул ДНК
4.2.1.6 Фосфорилирование фрагментов ДНК. Введение радиоактивной метки 32Р с помощью Т4-полинуклеотидкиназы
4.2.1.7 Лигирование 118
4.2.1.8 Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в ПААГ и агарозном геле
4.2.1.9 Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
4.2.1.10 Элюция фрагментов ДНК из ПААГ 119
4.2.1.11 Гибридизация ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах 120
4.2.1.12 Иммуноблоттинг 121
4.2.1.13 Определение нуклеотидных последовательностей 122 фрагментов ДНК
4.2.1.14 Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных 122 последовательностей 4.2.2 Частные методики исследования 123
4.2.2.1 Получение рекомбинантной плазмиды pIL2m 123
4.2.2.2 Получение рекомбинантной плазмиды pIL4s 123
4.2.2.3 Конструирование рекомбинантной плазмиды pFHAslO, кодирующей А-субъединипу токсина шигеллы
4.2.2.4 Реконструкция плазмиды pIL2 с получением целевой плазмиды pIL2d
4.2.2.5 Получение плазмиды pRIL3 125
4.2.2.6 Получение плазмид pRIL2mHpRIL2s 125
4.2.2.7 Получение плазмид pRILA4 и pRAIL3, направляющих синтез химерных белков ILA и AIL
4.2.2.8 Реконструкция плазмид pRIL3, pRIL18, pRILA4, pRAIL3 и сравнительный анализ уровней синтеза целевых рекомбинантных белков
4.2.2.9 Получение экспрессионной плазмиды pRTUl
4.2.2.10 Получение рекомбинантных плазмид pRIRinT и pRIRgT 128
4.2.2.11 Синтез и экспрессия гена аналога человеческого анафилатоксина С5а
4.2.2.12 Экспрессия гена ангиогенина 130
4.2.2.13 Синтез искус ственного гена Т CI 130
4.2.2.14 Конструирование рекомбинантной плазмиды pFHCI 134
4.2.2.15 Получение плазмид рЕТCI и pGEXCI 135
4.2.2.16 Получение плазмид pBK-RSVCI и pcDNACI 136
4.2.2.17 Конструирование экспрессионных векторных плазмид pVl, pV2 и pV3
4.2.2.18 Сборка генетических конструкций СІ, С2, СЗ и их клонирование в векторах pVl, pV2 и pV3
4.2.2.19 Получение рекомбинантных плазмид, направляющих синтез белков вируса ККГЛ
4.2.2.20 Методика индикации генетического материала вируса ККГЛ в образцах методом ОТ-ПЦР
5 Результаты и обсуждение 142
5.1 Конструирование рекомбинантных плазмид, обеспечивающих экспрессию гена интерлейкина-2 (IL-2) человека и его мутантных аналогов в клетках Escherichia coli
5.1.1 Краткая характеристика IL-2 человека 142
5.1.2 Получение мутантных генов IL-2 человека 143
5.1.3 Экспрессия гена IL-2 человека и его мутантных аналогов в клетках Е. coli
5.2 Конструирование рекомбинантных плазмид, обеспечивающих синтез в клетках Escherichia coli химерных белков, состоящих из IL-2 человека и цитотоксической А-субъединицы токсина шигеллы
5.2.1 Краткая характеристика химеротоксинов, содержащих IL-2 156
5.2.2 Реконструкция генов IL-2 человека и цитотоксической 158 А-субъединицы токсина шигеллы с целью получения генов химеротоксинов ILA и AIL
5.2.3 Конструирование и экспрессия генов ILA и AIL, 161 кодирующих химерные белки, состоящие из IL-2 человека и цитотоксической А-субъединицы токсина шигеллы
5.3 Синтез, клонирование и экспрессия в клетках Escherichia coli 169
гена аналога анафилатоксина С5а человека
5.3.1 Краткая характеристика человеческого анафилатоксина С5а 169
5.3.2 Химико-ферментативный синтез и клонирование гена аналога человеческого анафилатоксина С5а
5.3.3 Экспрессия гена аналога человеческого анафилатоксина С5а 170
5.4 Конструирование и проверка экспрессионной векторной плазмиды pRTUl
5.4.1 Получение экспрессионной векторной плазмиды pRTUl 174
5.4.2 Проверка экспрессионной векторной плазмиды pRTU 1 175
5.5 Получение белков вируса натуральной оспы, гомологичных рецептору у-интерферона человека, в клетках Escherichia coli
5.5.1 Краткая характеристика белков вируса натуральной оспы, гомологичных рецептору у-интерферона человека
5.5.2 Получение белков вируса натуральной оспы, гомологичных рецептору у-интерферона человека, в клетках Е. coli с помощью экспрессионной плазмиды pRTUl
5.6 Экспрессия синтетического гена ангиогенина человека в клетках Escherichia coli с использованием векторной плазмиды pRTUl
5.6.1 Краткая характеристика ангиогенина 182
5.6.2 Эффективная экспрессия гена ангиогенина человека в клетках Е. coli
5.7 Конструирование рекомбинантных плазмид pBK-RSVCI и pcDNACI, содержащих искусственный ген TCI, кодирующий множественные CTL-эпитопы основных антигенов ВИЧ-1, как кандидатных ДНК-вакцин
5.7.1 Общая характеристика искусственного иммуногена TCI 186
5.7.2 Получение искусственного гена TCI, кодирующего множественные CTL-эпитопы основных антигенов ВИЧ-1
5.7.3 Получение белка TCI в рекомбинантном виде и доказательство его иммунохимической, иммуногенной и антигенной специфичности
5.7.4 Клонирование гена TCI в векторных плазмидах, обеспечивающих его экспрессию в эукариотических клетках: получение плазмид pBK-RSVCI и pcDNACI
5.8 Создание генетических конструкций с оптимизированной структурой генов полиэпитопных иммуногенов для высокоэффективной индукции CTL-ответов
5.8.1 Общий дизайн полиэпитопных иммуногенов. Краткая характеристика
5.8.2 Общий дизайн, стратегия клонирования и кодирования рекомбинантных плазмид, направляющих синтез полиэпитопных CTL-иммуногенов
5.8.3 Схемы конструирования экспрессионных векторных плазмид pVl, pV2 и pV3, предназначенных для клонирования полиэпитопных CTL-иммуногенов
5.8.4 Синтез и клонирование генов полиэпитопных CTL-иммуногенов в экспрессионных векторных плазмидах pVl, pV2 и pV3
5.9 Разработка различных методов диагностики и подходов к вакцинопрофилактике Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ)
5.9.1 Краткая характеристика ККГЛ 219
5.9.2 Методы и проблемы диагностики ККГЛ 221
5.9.3 Получение белков вируса ККГЛ в рекомбинантном виде и исследование их антигенных свойств
5.9.4 Разработка диагностической тест-системы для выявления 229 РНК вируса ККГЛ в биологических образцах методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)
5.9.5 Дифференциация геновариантов вируса ККГЛ путем 233 анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), полученных в результате ОТ-ПЦР
5.9.6 Разработка подходов к вакцинопрофилактике ККГЛ: 238 конструирование рекомбинантных плазмид в качестве кандидатных ДНК-вакцин против ККГЛ
6 Заключение 248
7 Выводы 251
6 Список работ, опубликованных по теме диссертации
8.1 Работы, опубликованные в научных журналах, рекомендованных ВАК
8.2 Патенты 258
8.3 Работы, опубликованные в сборниках научных трудов, материалах конференций и других изданиях
9 Список литературы
